一种检测b、e型人腺病毒核酸的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种病毒核酸检测试剂盒，特别设及一种检测B、E型人腺病毒核酸的 试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 人腺病毒是一类无包膜的双链DNA病毒，分为A-G 7个血清学组，现已发现60多个 血清型，HAdV感染人体可引发急性腺病毒型肺炎、急性胃肠炎、眼角膜炎、乳糜泻和急性间 质性肾炎等多种疾病。腺病毒作为普通的机会性病原体长期存在于人群中，在居住密集的 人群，如军队、学校人员中都可引起暴发流行。
[0003] 不同的腺病毒亚种会引起不同的疾病，C亚种主要引起小儿科的上呼吸道感染，人 腺病毒F亚种会引起感染性腹泻，B亚种和E亚种可长引起成人急性发热性呼吸道疾病，在成 人特别是学校和军队特殊人群中引起日益频繁的急性呼吸道传染病流行，由于传染性强且 症状较重，严重者可引起死亡，因而引起人们广泛关注。
[0004] 腺病毒主要通过呼吸道和消化道传播，具有较高传染性，因此快速、准确的检测技 术对预防和控制腺病毒的传播有重要意义。目前，检测方法大体概括可分为两类免疫学方 法和分子生物学方法。前者主要包括化ISA技术。但是此技术存在一定的局限性即免疫检测 法实效性低，在感染初期抗体未形成时无法准确检测。分子生物学方法主要为PCR技术。但 是PCR技术对仪器及实验室的要求高，运些局限性使其应用大多限制于条件优良的实验室 内，无法作为便携式仪器应用于现场防疫检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对目前腺病毒诊断技术存在的缺陷，提供一种新型的基于RPA- LFD技术的检测B、E型人腺病毒核酸的试剂盒及其检测方法。
[0006] -种检巧化、E两型人腺病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括:RPA冻干颗粒，RPA反 应引物，RPA反应探针，RPA缓冲液，儀盐溶液，横向流动试纸条，缓冲液，双蒸水和腺病毒基 因组DNA。
[0007] 所述1??4反应引物的序列如序列表569 10齡.1和569 10齡.2所示。
[000引所述RPA反应探针的序列如序列表SEQ ID No.3所示。
[0009] 所述RPA冻干颗粒包括隧菌体重组酶UvsX，辅助因子UvsY，DNA聚合酶，单链DNA结 合蛋白和dNTPs。
[0010] 所述儀盐溶液为醋酸儀溶液。
[00川序列表中沈Q ID No.2所示的引物的5'端用生物素标记。
[001 ^ 所述RPA反应探针中，5 '端用FAM标记，32位碱基用一个四氨巧喃碱基隔开。
[0013] 所述横向流动试纸条前端包被有带FAM抗体的纳米金粒，检测线上包被有生物素 抗体，质控线上包被有固定抗体。
[0014] -种非医疗目的的检测B、E两型人腺病毒核酸的方法，按照如下步骤进行：
[0015] (1)反应体系：在RPA冻干颗粒中加入25-3化L反应缓冲液，2.0-2.3化lOiiM序列表 SEQIDNo.l所示的引物，2.0-2.310μM序列表沈QIDNo.2所示的引物，0.6-l化10μMRPA 反应探针，1-3化乙型脑炎病毒基因组DNA，10.2-12.2化双蒸水，在反应管盖上加醋酸儀溶 液2.化L，盖严管盖并离屯、，使醋酸儀与溶液混合，上下颠倒反应管使之充分混匀后再次离 屯、；
[0016] (2)反应过程:利用带生物素标记的引物和FAM标记的RPA反应探针与祀核酸进行 扩增反应，使最终扩增产物同时携带FAM和生物素标记，横向流动试纸条前端包被有带FAM 抗体的纳米金粒，检测线上包被有生物素抗体，当反应液进入试纸条时，带有FAM和生物素 的扩增产物就会通过抗原抗体结合作用，在检测线上形成生物素抗体-核酸-纳米金粒复合 体并显色，横向流动试纸条上还有一条质控线，包被有固定抗体，直接与带FAM抗体的纳米 金粒结合，在质控线上显色；
[0017] (3)结果判定:待测样品中含有B、E型人腺病毒核酸的，试纸条可见两条线;不含腺 病毒核酸的，试纸条上只可见一条质控线。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:本发明利用横向流动试纸条对RPA核 酸扩增产物进行可视化定性检测，整个反应在38°C恒溫条件下进行，5-20分钟内即可通过 肉眼观察试纸条上条带，判读结果，检测过程无需特殊检测仪器。本发明所述试剂盒具有灵 敏度高，特异性强，操作简便，反应快速，仪器设备便携等特点，非常适合应用于腺病毒的床 旁快速诊断及防疫疾控。
【附图说明】
[0019] 图1是应用本发明的方法对B-7,14,55Ξ型腺病毒及无感染患者进行检测的结果 图；
[0020] 图中，1-2，B-7型腺病毒标本;3-4, B-14型腺病毒标本;5-6，B-55型腺病毒标本;γ? ιο ， 无腺病毒感染标本; 11 ， 双蒸水。
[0021 ]图2是应用本发明的方法对Β-7，14，55型人腺病毒、乙脑病毒、血吸虫及大肠杆菌 进行检测的结果图；
[0022] 图中，1，Β-7型腺病毒标本;2，Β-14型腺病毒标本;3，Β-55型腺病毒标本;4，血吸虫 核酸;5，乙型脑炎病毒核酸;6，大肠杆菌核酸;7，双蒸水。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图，对本发明的【具体实施方式】进行详细描述，但应当理解本发明的保 护范围并不受【具体实施方式】的限制。
[0024] 实施例1 [00巧]实验材料；
[00%] RPA冻干试剂、缓冲液及儀盐溶液购自Twi S tDX公司Twi stAmpTM试剂盒;横向流动 试纸条及其缓冲液购自Mi lenia Biotec公司HybriDetect MG皿1试剂盒。
[0027] 实验原理：
[0028] 利用带生物素标记的引物和FAM标记的探针与祀核酸进行扩增反应，使最终扩增 产物同时携带FAM和生物素标记。LF的式纸条前端包被有带FAM抗体的纳米金粒，检测线上包 被有生物素抗体，当反应液进入试纸条时，带有FAM和生物素的扩增产物就会通过抗原抗体 结合作用，在检测线上形成生物素抗体-核酸-纳米金粒复合体并显色。横向流动试纸条上 还有一条质控线，包被有固定抗体，可W直接与带FAM抗体的纳米金粒结合，在质控线上显 色，W确保试纸条的有效性。
[0029] 引物设计：
[0030] 从Geneba址下载B、E型人腺病毒编码六邻体蛋白的基因序列，
[0031] 应用软件进行