用于在胱天蛋白酶抑制剂存在下无细胞蛋白合成的方法和装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及在脫天蛋白酶抑制剂的存在下使用真核细胞裂解物进行无细胞蛋白 合成的改进的方法、用于进行此方法的装置、W及在此种使用真核细胞裂解物合成蛋白的 无细胞方法中脫天蛋白酶抑制剂用于提高所合成蛋白的产率和/或稳定性的用途。
【背景技术】
[0002] 近来，无细胞蛋白合成已经成为体内蛋白表达的有效替代(化rlson，E.D.et al.， Biotechnology Advances，2012,30(5) :pp. 1185-1194)。在本文中，使用细胞内含物W便W 快速、可靠 W及有成本效益的方式来制造特定的目标蛋白。所获得的细胞提取物也称作细 胞裂解物，含有无细胞蛋白合成所需的基本成分:核糖体、翻译因子和酶。如今，可W在原核 细胞W及真核细胞裂解物中W有功能活性的形式制造选定的重组蛋白。目前，如下基于真 核细胞裂解物的翻译系统的使用日益增多：麦胚裂解物、网状细胞裂解物、昆虫细胞裂解 物、W及来自化La和化La杂交瘤细胞的细胞提取物。
[0003] 与基于大肠杆菌巧scherichia coli)的原核体外翻译系统相比，使用大部分真核 翻译系统的蛋白产率相对较低(上文的化rlson et al.)。运一方面的例外是极其有效的麦 胚裂解物表达系统。基于蛋白和反应形式，其实现了每毫升反应体积几百微克蛋白（Madin， K.et al.，Proc.化 tl. Acad. Sci. USA, 2000.97(2) :pp. 559-64)。然而，此细胞提取物不适宜 用于合成具有翻译后修饰(例如糖基化)的蛋白。
[0004] 基于昆虫细胞裂解物和网状细胞裂解物的真核翻译系统使得可W合成具有翻译 后修饰的复杂结构的蛋白（其不能在大肠杆菌中合成）。然而，网状细胞裂解物必需为此目 的而用另一物种的微粒体膜进行富集化（非均质翻译系统）。与之相反，来自草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)的细胞裂解物可W用作均质翻译系统，运是由于所述细胞裂解 物与所含有的膜小泡源自相同的细胞系。通过适宜的细胞分解方法的措施，可W获得含有 重要的细胞区室(具体而言内质网）成分的真核细胞裂解物。从细胞排出的或者渗入细胞膜 内的所有蛋白，携带有糖残基或者具有二硫桥用于稳定其分子结构，迁移穿过此细胞区室。 含有ER结构(所谓的微粒体或膜小泡）的细胞裂解物，现在可W用于制造具有功能活性形式 的此类蛋白候选。W此方式，防止了裂解物的小泡和细胞质蛋白之间的不匹配性，结果是相 对较高的蛋白产率(在分批模式的昆虫细胞裂解物中达到20μg/ml)W及目标蛋白有效转移 至裂解物的微粒体内。
[0005] 无细胞蛋白合成反应在实验上可W通过各种方式来实现。最简单的反应路径是在 一锅反应(分批反应）中合成目标蛋白。基于分批的系统因而适宜用于目标蛋白不复杂且快 速的合成。然而另一方面，其特征是短的运行时间W及相对较低的蛋白产率。
[0006] -般而言，基于分批的无细胞翻译反应在1-1.5小时后达到所合成目标蛋白的最 大值。超过此时间的溫育时间并不会导致蛋白产率增加，而很大可能会导致目标蛋白浓度 的降低，运可能是由于目标蛋白的蛋白水解分解，例如由细胞提取物中存在的蛋白酶所分 解。然而，在特定的情况下高度有利的是，还将所合成的目标蛋白w完整的形式保存在翻译 溶液中更长的溫育时间（〉化）。
[0007] 延长无细胞蛋白合成反应的运行时间W便由此获得更高的蛋白产率的一种可能 是，使用透析系统（持续交换无细胞系统，CECF;Spirin，A. et al.，Science ,1988,242 (4882):pp. 1162-4)。在本文中，高能物质如ATP和GTP通过扩散穿过膜进入反应区室内（进 行翻译的处所）。同时，反应耗尽了抑制性物质如游离的憐酸盐和ADP。
[0008] 在反应区室中连续供应无细胞反应延长了合成的运行时间，并且导致与分批系统 相比显著提高的蛋白产率。此类型的透析系统已经是商业可购买的，虽然只会与原核细胞 裂解物(来自大肠杆菌)或者与麦胚裂解物组合提供。
[0009] 尽管与不连续的分批系统相比产率提升，但是使用相应真核透析系统的蛋白产率 与基于大肠杆菌的系统相比依然相对较低。
[0010] 针对此背景，本发明的目的是提供运样的措施，其使得能够在无细胞翻译系统中， W相对较大的量合成稳定且有功能活性形式的复杂真核和原核蛋白，特别是膜蛋白或者具 有翻译后修饰的蛋白。
[0011] 根据本发明此目的是通过W下来实现的:权利要求1的无细胞蛋白合成方法(其中 使用真核细胞裂解物并且所述体外翻译反应是在脫天蛋白酶抑制剂的存在下进行的）、权 利要求13和15中脫天蛋白酶抑制剂的用途、W及权利要求17中用于进行本发明方法的装 置。本发明更具体的或者优选的实施方案W及方面是从属权利要求的主题。
【发明内容】
[0012] 本发明的主要方面设及无细胞蛋白合成的方法，其包括使用核酸模板和真核细胞 裂解物的体外翻译反应，特征在于所述翻译反应是在脫天蛋白酶抑制剂的存在下进行的。
[0013] 所使用的真核细胞裂解物并无特别的限制并且基本上包含任何细胞裂解物(其含 有核酸模板的体外翻译所需的所有成分）。特别优选的是也能够合成具有翻译后修饰的复 杂蛋白的细胞裂解物。
[0014] 在更具体的实施方案中，所使用的真核细胞裂解物选自包含W下的组:麦胚裂解 物，昆虫细胞裂解物，特别是Sf 21细胞裂解物，网状细胞裂解物，角化细胞裂解物，来自C册 细胞、Hela细胞、杂交瘤细胞或培养的淋己瘤细胞的细胞提取物。
[0015] 运些细胞裂解物可W其天然形式使用，或者通过添加或去除特定成分而经过修 饰。
[0016] 如果主要得自一种细胞系的细胞裂解物不含有例如膜小泡(如网状细胞裂解物）， 运些可W从例如另一细胞系的裂解物来添加，W便使得能够合成具有翻译后修饰的蛋白。 另外，裂解物中膜小泡的存在是膜蛋白嵌入天然的脂质-蛋白基质(其保证了膜蛋白的正确 折叠和构象)的前提条件。
[0017] 相反，对于特定蛋白的合成，使用天然不含膜小泡(或者例如通过离屯、步骤去除了 小泡）的细胞裂解物可W是有利的。使用此种"小泡耗尽的"细胞裂解物可W导致特定蛋白 的产率提高(参见实施例1，图1)。
[0018] 所述"小泡耗尽的"细胞裂解物也是有翻译活性的并且可W用于不具有翻译后修 饰的蛋白的无细胞合成。
[0019] 所使用的细胞裂解物的成分因而可W是源自一种细胞系的细胞(均质翻译系统） 或者不同细胞系的细胞(非均质翻译系统）。原则上也可W使用人工细胞裂解物，其中一种 或多种成分经过合成产生。
[0020] 用于进行本发明方法的反应混合物，其在所述真核细胞裂解物和所述脫天蛋白酶 抑制剂之外含有至少一种核酸模板、聚合酶、氨基酸、W及高能物质如ATP、GTP等。原则上， 可W使用已知用于体外翻译系统的所有反应混合物和成分（在添加脫天蛋白酶抑制剂之 后）。所述反应混合物还可能含有另外的添加剂，其促进特定目标蛋白的合成或者稳定性， 例如DTT或其它还原剂，特别是还原的和氧化的谷脫甘肤的混合物。
[0021] 如下文所述的实验W及测试数据所示，将脫天蛋白酶抑制剂添加至无细胞真核翻 译系统中（特别是使用连续透析系统），令人吃惊地显著提高了蛋白产率，对于具有翻译后 修饰的复杂蛋白也是如此。
[0022] 脫天蛋白酶抑制剂对于无细胞蛋白合成反应合成性能的此种作用的生化机制目 前还不清楚。在细胞破裂期间，细胞经受巨大的压力，其可能诱导调亡过程。调亡也称作"程 序化细胞死亡"，其基本上由具有蛋白水解活性的酶类别控制，也即所述的"脫天蛋白酶"。 据推测脫天蛋白酶抑制剂对脫天蛋白酶的抑制延长了裂解物中特定翻译因子的寿命，运继 而会对细胞提取物的整体合成产出有正面作用。
[0023] 在使用真核细胞裂解物的无细胞蛋白合成系统中存在脫天蛋白酶抑制剂的另外 的优势在于，对所合成的蛋白稳定性的正面影响，特别是在运些蛋白于翻译混合物中保持 较长(例如〉1.5h)的条件下。运设及例如运样的反应，其中一种或多种目标蛋白的无细胞合 成在同一微粒体混合物中于多个相继的合成中发生。此种类型的反应路径已知为"多重或 重复合成"并且用于使重新合成的目标蛋白在微粒体小泡的腔或膜中富集。
[0024] 原则上，脫天蛋白酶(特别是目前已知的脫天蛋白酶1-14型的一种）的任何可逆或 不可逆的抑制剂，都适宜用作脫天蛋白酶抑制剂。脫天蛋白酶抑制剂在例如W下的出版物 中有描述：C 曰 llus ,Β.Α.曰 nd D . L. V曰 ux , C曰 sp 曰 se inhibitors