用辅助寡核苷酸电化学检测的系统、方法和装置的制造方法
【专利说明】用辅助寡核音酸电化学检测的系统、方法和装置
[0001] 相关申请交叉引用 本申请要求2013年8月7日提交的美国临时申请61/863,280的优先权，所述申请全文通 过引用结合到本文中。
[0002] 序列表 本申请包含WASCII格式电子提交的序列表，全文通过引用结合到本文中。在2014年7 月25日创建的所述ASCII副本名为109904-0013-胖01_化.txt，1，316肺大小。
[000引背景 研发能够W高灵敏度和特异性检测核酸祀的低成本、高通过量传感器非常理想。很多 标准诊断分析，例如细胞培养和利用PCR扩增的基因检验，需要将样品送到实验室，并有数 天或数星期的长周转时间。在运些情况下，很多患者不回到护理提供者处接收结果或接受 治疗，在一些情况下，长周转可损及适当治疗疾病的能力。虽然快速现场护理分析在发展 中，但在运些系统中难W实现减少假阳性和假阴性结果出现所必需的高灵敏性和特异性。 因此，提高灵敏性和特异性的替代系统和方法可有益于改进现场护理应用。
[0004] 概述 本文公开用辅助寡核巧酸(各自为辅助寡聚体或共同为辅助寡聚体）电化学检测祀的 系统、装置和方法。根据一个方面，为了提高电化学检测的灵敏性，用辅助寡聚体(带负电荷 的氨基酸序列)通过捕捉分子提高杂交到祀分子时存在的电荷的量。在一些实施方案中，辅 助寡聚体可杂交到RNA/DNA的一部分。然后，RNA/DNA祀可结合到相反互补性的电极结合PNA 探针。一旦结合到探针，整个复合体(祀和辅助序列)就增加电极表面的总电荷，运增大检测 信号的大小。在结合到祀时，辅助寡聚体可比无辅助寡聚体存在下祀结合到探针更加增加 表面电荷和检测灵敏度。辅助寡聚体也可标记到或连接到带电荷部分，运进一步在与祀杂 交时增加电荷。另外，在检测前施加包含祀的样品时，辅助寡聚体可展开可部分不能接近探 针的DNA/RNA祀的区域，因此允许探针更有效结合到祀内的所需序列。另外，通过展开祀序 列，辅助寡聚体可通过提高到祀序列的可接近性减小非特异结合效应。
[0005] 附图简述 通过研究W下详述并结合附图，前述和其它目的和优点显而易见，其中在全文中相似 的附图标记指相似部件，其中： 图1描绘根据一些实施方案的电化学检测祀的示意图； 图2描绘根据一些实施方案指示祀存在/不存在的电化学读出； 图3描绘根据一些实施方案的基于纳米结构微电极的电化学检测器； 图4A、4B、4C和4D描绘根据一些实施方案用辅助寡聚体电化学检测的示意图； 图5A和5B描绘根据一些实施方案辅助寡聚体的酶促扩延； 图6A、6B和6C描绘根据一些实施方案辅助寡聚体用滚环扩增来酶促扩延； 图7A和7B描绘根据一些实施方案用带电荷部分标记的辅助寡聚体； 图8A和8B描绘根据一些实施方案用支化寡核巧酸结构标记的辅助寡聚体； 图9A、9B、9C和9D描绘根据说明性实施方案的试验结果； 图10描绘根据一些实施方案用辅助寡聚体进行电化学检测的室； 图11描绘用辅助寡聚体检测祀的说明性过程； 图12描绘根据一些实施方案接收、制备和分析生物样品的盒系统； 图13描绘根据一些实施方案的分析检测系统的盒;并且 图14描绘根据一些实施方案的自动检验系统。
[0006] 详述 为了全面理解本文所述系统、装置和方法，将描述某些说明性实施方案。应了解，本文 公开的系统、装置和方法，虽然显示用于检测生物疾病标记的诊断系统，但也可用于需要复 合电化学分析的其它系统。
[0007] 图1-4描绘通过电化学方法检测祀分析物的说明性工具、传感器、生物传感器和技 术，分析物包括细胞、分子或组织组分。图1描绘用生物传感器系统电化学检测核巧酸链。系 统700包括电极702,该电极702具有通过连接体704连接到电极702的关联探针706。探针706 为能够结合到生物标记祀(例如，受体、配体)或与其相互作用W指示样品中配体或受体存 在的分子或分子团，例如核酸（例如，DNA、RNA、cDNA、mRNA、rRNA等）、寡核巧酸、肤核酸 (PNA)、锁定核酸、蛋白（例如，抗体、酶等)或肤。连接体704为例如通过化学键(例如，硫醇 键)使探针706连结到电极702的分子或分子团。
[0008] 在一些实施方案中，探针706为能够通过一个或多个类型化学键结合到祀核酸序 列的多核巧酸，所述化学键例如互补碱基配对和氨键形成。也将此结合称为杂交或复性。例 如，探针706可包括天然产生的核巧酸和核巧碱，例如腺嚷岭(A)、鸟嚷岭(G)、胞喀晚(C)、胸 腺喀晚(T)和尿喀晚化)或改性碱(例如7-脱氮鸟巧和肌巧）。探针706中的碱可通过憐酸二 醋键（例如，DNA和RNA分子)或用其它类型键连接。例如，探针706可W为肤核酸(PNA)低聚 体，其中组成碱通过肤键连接，而不是憐酸二醋键。肤核酸(PNA)低聚体可包含由肤键连接 的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成的主链。肤核酸具有与互补核酸低聚体的较高结合亲 和性和提高的特异性，因此，特别可有利于本文所述诊断和其它传感应用。
[0009] 在一些实施方案中，探针706具有与祀标记712部分或完全互补的序列，例如寻求 的核酸序列。祀标记712为用于检测的分子，如W下更详细描述。在一些实施方案中，探针 706为能够结合到寻求检测的祀核酸的至少一部分的单链寡核巧酸。在某些方法中，探针 706具有与祀序列不互补的区域，例如W调节链间杂交，或在分析期间作为无义或阴性对 照。探针706也可包含其它部分，例如纵向间隔基、双链区域、单链区域、聚(T)连接体、和作 为刚性连接体和PEG间隔基的双链体。在某些方法中，电极702可装配有用于多种不同祀712 的多种不同探针706。
[0010] 探针706包括促进探针706结合到电极702的连接体704。在某些方法中，连接体704 与探针706关联，并结合到电极702。例如，连接体704可W为官能团，例如硫醇、二硫醇、胺、 簇酸或氨基。例如，它可W为连接到多核巧酸探针的5'端的4-琉基苯甲酸。在某些方法中， 连接体704与电极702关联，并结合到探针706。例如，电极702可包括胺、硅烷或硅氧烷官能 团。在某些方法中，连接体704独立于电极702和探针706。例如，连接体704可W为溶液中结 合到电极702和探针706二者的分子。
[0011] 在适合条件下，例如，在适合的杂交缓冲剂中，探针706可杂交到互补祀标记712， W指示样品中祀标记712的存在。在某些方法中，样品为来自生物宿主的生物样品。例如，样 品可w为组织、细胞、蛋白质、流体、基因物质、细菌物质或病毒物质、植物质、动物质、培养 细胞或其它有机体或宿主。样品可W为全有机体或其组织、细胞或组成部分亚组，可包括细 胞或非细胞生物物质。流体和组织可包括但不限于血液、血浆、血清、脑脊液、淋己、眼泪、唾 液、血液、粘膜、淋己液、滑液、脑脊液、羊水、羊膜厮血、尿、阴道液、精液、眼泪、乳汁和组织 切片。样品可包含核酸，例如，脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸和核糖 核酸的共聚物或其组合。在某些方法中，祀标记712为已知对宿主、病原体、疾病或性状独特 的核酸序列，换针706提供勒1标记712序列的互补序列，W允许检测样品中的宿主序列。
[0012] 在某些方面，本发明提供对样品进行处理步骤(例如，纯化和提取)的系统、装置和 方法。可在细胞、细菌或病毒内馨合用于检测的分析物或祀分子，例如核酸。可处理样品，W 分离、隔离或接近在样品中包含的各种组分、组织、细胞、片断和分子。处理步骤可包括但不 限于纯化、均化、溶解和提取步骤。处理步骤可分离、隔离或接近在样品中或来自样品的祀 标记，例如祀标记712。
[0013] 在某些方法中，祀标记712为DNA或RNA形式的基因物质，从天然存在的原核生物 (例如，病原或非病原菌(例如，大肠埃希杆菌、沙口氏菌、梭菌、衣原体等））、真核生物（例 如，原生动物、寄生虫、真菌和酵母菌）、病毒(例如，瘤疹病毒、HIV、流感病毒、埃己病毒、乙 型肝炎病毒等）、植物、昆虫和动物(包括人)及组织培养中的细胞得到。来自运些源的祀核 酸可例如发现于来自动物(包括人)的体液的生物样品。在某些方法中，样品从生物宿主(例 如，患者)得到，且包括非人物质或有机体，例如细菌、病毒、其它病原体。
[0014] 可任选在检测前扩增祀核酸分子，例如祀标记712。祀核酸可W为双链或单链形 式。在扩增反应开始时，可通过例如加热、碱处理方法或通过酶促处理用变性剂处理双链形 式，W使双链成为单链形式或部分单链形式。
[0015] 一旦已处理样品W暴露祀核酸，例如祀分子712,就可如本文所述检验样品溶液， W检测探针706和祀分子712之间的杂交。例如，可应用电化学检测，如W下更详细讨论。如 果在样品中不存在祀分子712,则本文所述系统、装置和方法可检测没有祀分子存在。例如， 在诊断细菌病原体的情况下，例如沙眼衣原体(CT)，在样品中存在祀分子，例如，来自沙眼 衣原体的RNA序列，将指示生物宿主(例如患者）中存在该细菌，在样品中不存在祀分子指示 宿主未感染沙眼衣原体。同样，其它标记可用于其它病原体和疾病。
[0016] 参考图1，系统700的探针706杂交到互补祀分子712。在某些方法中，通过互补碱基 配对杂交。在某些方法中，也可发生失配或不完全杂交。"失配"一般指在杂交期间两种不同 核酸链(探针和祀)之间非互补核巧酸的配对。一般认为互补配对为A-T、A-U和C-G。局部环 境条件，例如离子强度、溫度和pH，可影响碱基之间可能出现失配的程度，也可将此称为杂 交的"特异性"或"严格性"。其它因素，例如核巧酸序列的长度和探针类型，也可影响杂交的 特异性。例如，较长核酸探针具有对于失配比较短核酸探针更高的容限。
[0017] 如图中所示，通过电化学技术确定样品中存在或不存在祀标记712。运些电化学技 术允许检测极低含量的核酸分子，例如从生物宿主得到的祀RNA分子。电化学技术的应用更 详细描述于美国专利7，361，470和7，741，03及PCT申请PCT/US12/024015，所述专利全文通 过引用结合到本文中。W下提供应用于