一种蛋白质-多酚共价复合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品科学和食品添加剂技术领域，具体涉及一种蛋白质-多酚共价复 合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] β_胡萝卜素作为类胡萝卜素的一种，具有较强的抗氧化活性，能够有效降低心血管 疾病和癌症的发病率，提高人体免疫力。然而，胡萝卜素为脂溶性化合物，很难应用于水溶 液体系；而且对光、热和氧敏感，容易发生降解;体内吸收少，生物利用率低，这明显限制了 胡萝卜素在食品和医药等领域的广泛应用。将胡萝卜素制备成乳状液不仅可以解决胡 萝卜素的溶解性问题，而且可以提高其稳定性，同时还具有靶向性和缓释等优点。
[0003] 小分子表面活性剂是制备乳状液常用的乳化剂，如专利CN200710119789.2采用 tween 40、tween60或tween80制备水分散型β-胡萝卜素浓缩液。与表面活性剂相比，来源于 植物和动物的天然蛋白质具有较高的生物利用率，而且安全性较高，乳化性好，可用于构建 以乳状液为基础的传递系统，对胡萝卜素具有更好的保护作用。采用单一蛋白质为乳化剂 制备的胡萝卜素乳状液虽然安全性好，但易受温度、pH值、离子强度等的影响，理化稳定性 差。
[0004] 植物多酚具有芳环结构并结合一个或多个羟基，是目前研究最受关注的一类天然 抗氧化剂。近年来对多酚物质在人体内生理活性的研究表明，多酚具有抗氧化、清除自由 基、抑制肿瘤、抗诱变、降低毛细管通透性、改善人体微循环等多种药理作用，且具有高效、 低毒、高生物利用率的特点，因此被广泛应用于食品工业、生物医药、卫生保健、日用化工等 领域。
[0005] 现有研究表明，蛋白质与多酚的复合物能够提高乳状液的化学稳定性，有效降低 活性物质的降解速率。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种蛋白质-多酚共价复合物及其制备方法和应用。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
[0008] -种蛋白质-多酚共价复合物的制备方法，所述的制备方法为:利用蛋白质与多酚 的自由基接枝聚合反应或碱诱导反应，制备蛋白质-多酚共价复合物。
[0009] 所述制备方法之一是利用蛋白质与多酚的碱诱导反应，具体步骤为：
[0010] 将多酚溶解于pH值为8.0-10.0的缓冲液或pH值为8.0-10.0的去离子水中，形成多 酚溶液;将蛋白质溶解于pH值为8.0-10.0的缓冲液或pH值为8.0-10.0的去离子水中，形成 蛋白质溶液;所述蛋白质溶液与多酚溶液中，蛋白质与多酚的质量比为(20:1 )-(2:1);
[0011] 在室温或50_60°C的水浴加热条件下，将多酚溶液与蛋白质溶液等体积混合，形成 混合溶液，并调节混合溶液的pH值为8.0-10.0;然后向反应容器中缓慢通入氧气，反应18-36h，反应过程不断搅拌，使得多酚氧化成醌类化合物并与蛋白质的侧链氨基酸反应生成蛋 白质-多酚共价复合物;将反应后的样品超声透析并进行真空冷冻干燥，得到蛋白质-多酚 共价复合物固体样品；
[0012] 所述制备方法之二是利用蛋白质与多酚的自由基接枝聚合反应，具体步骤为：
[0013] 将蛋白质溶解在去离子水中，加入双氧水和抗坏血酸，室温下静置反应，形成蛋白 质溶液;然后按蛋白质与多酚的质量比为(20:1)-(2:1)，向蛋白质溶液中加入多酚，在室温 下继续静置反应24_48h，将反应后的样品超声透析并进行真空冷冻干燥，得到蛋白质-多酚 共价复合物固体样品。
[0014] 所述的蛋白质为大豆分离蛋白、乳蛋白、血清蛋白、卵蛋白、鱼糜蛋白、明胶或胶原 蛋白；所述的乳蛋白为乳白蛋白、β_乳球蛋白、乳铁蛋白或酪蛋白；
[0015] 所述的多酚为表没食子儿茶素没食子酸酯、绿原酸、没食子酸、阿魏酸、儿茶素、花 青素或橙皮素。
[0016] 所述的蛋白质的用量为10g/L-200g/L;双氧水的用量为2g/L-12g/L;抗坏血酸的 用量为 2g/L-10g/L;
[0017] 两种制备方法中，多酚与蛋白质的质量比均为(1:5)-(1:10)。
[0018] 所述的超声透析的方法为:在20-106KHZ的超声频率下，将透析袋固定于装有去离 子水的透析容器内，透析24-48h，每隔3-6h换一次去离子水，确保未反应的游离多酚完全透 析出去；
[0019] 所述透析袋截留的分子为3500-4000道尔顿，透析温度为4-8°C。
[0020] 所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
[0021 ]所述制备方法制备的蛋白质-多酚共价复合物。
[0022]所述的蛋白质-多酚共价复合物在制备β_胡萝卜素乳状液中的应用。
[0023]所述应用采取的方法为:将蛋白质-多酚共价复合物溶解于水中，得到水相;将β-胡萝卜素溶解于植物油中，得到油相;然后将水相与油相按(20:1)-(10:1)的体积比混合，在 8000-12000r/min的条件下剪切乳化6-10min，再进行高压均质，得到β-胡萝卜素乳状液； [0024]所述的高压均质方式为:在温度为45-75Γ的条件下，采用二级加压，均质1-5次； 其中，一级均质压力为30-60Mpa，二级均质压力为3-6Mpa。
[0025] 所述水相中蛋白质-多酚共价复合物的浓度为5g/L_50g/L;油相中β-胡萝卜素的浓 度为 0.5g/L-10g/L。
[0026] 本发明的有益效果为:所述蛋白质-多酚共价复合物的制备方法简单，不需要毒性 化学试剂及高温高压条件，所用的技术都在水相中进行，符合绿色环保要求；以所述复合物 为乳化剂制备的胡萝卜素乳状液具有良好的安全性、较高的理化稳定性和生物利用率，可 广泛应用于食品工业、生物医药和卫生保健等技术领域。
【附图说明】
[0027] 图1为蛋白质-多酚共价复合物的制备方法及其应用流程图。
[0028]图2为25 °C的贮存条件下α-乳白蛋白与α-乳白蛋白-EGCG共价复合物制备的β-胡 萝卜素乳状液中胡萝卜素的含量随时间的变化图。
[0029]图3为光照条件下乳铁蛋白和乳铁蛋白-绿原酸共价复合物制备的β-胡萝卜素乳状 液的色差(ΛΕ)随光照时间的变化图。
[0030] 图4为大豆分离蛋白和大豆分离蛋白-儿茶素共价复合物的乳化活性指数图。
【具体实施方式】
[0031] 本发明公开了一种蛋白质-多酚共价复合物的制备方法及其应用，其流程图如图1 所示。下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不应理解为对本发明的限制。所述原 料如无特殊说明均能从公开商业途径获得，所述测试方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0032] 实施例1:
[0033]首先利用0.5mo 1 /L的氢氧化钠溶液将去离子水的pH值调为9;然后称取0.5ga-乳 白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白和酪蛋白酸钠，分别溶解于50mL pH值为9的去离子水中，形 成四种乳蛋白溶液;将O.lg的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)溶于50mL pH值为9的去离 子水中，形成EGCG溶液；
[0034] 在120rpm的恒速搅拌条件下，将EGCG溶液分别加入到四种乳蛋白溶液中后通入空 气，形成反应体系;然后将反应体系在室温下，120rpm恒速搅拌24h进行反应;将反应后的样 品在在4°C、60KHz的超声频率下透析48h，每隔3h换水一次，除去未反应的游离EGCG，然后对 透析袋内剩余的液体进行冷冻干燥，得到四种乳蛋白-EGCG共价复合物。
[0035] 采用差示扫描量热法测量四种乳蛋白和四种乳蛋白-EGCG共价复合物的热变性温 度，结果如表1所示：
[0036] 表1:乳蛋白和乳蛋白-EGCG共价复合物的热变性温度的比较
[0037]
[0038] 从表1可知，乳蛋白-EGCG共价复合物的热变性温度均高于对应的乳蛋白，说明乳 蛋白与EGCG共价复合后，可提高乳蛋白的热稳定性。
[0039] 实施例2:
[0040] 取实施例1中的四种乳蛋白和四种乳蛋白-EGCG共价复合物，利用10mM的磷酸钠缓 冲液(pH = 7.0)分别配制成0.02-0.3mg/mL的蛋白质溶液或蛋白质-多酸共价复合物溶液， 同时配制8mM的8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)溶液。将20yL的ANS溶液分别加入4mL上述蛋白溶 液中并混匀。在波长390nm处激发荧光光谱，测定波长为470nm处的荧光强度，以样品的相对 荧光强度对蛋白质浓度作图，初始段的直线斜率即为该样品的表面疏水性指数，测定结果 如表2所示。
[0041 ]表2:乳蛋白和乳蛋白-EGCG共价复合物的表面疏水性指数的比较
[0042]
[0043] 从表2可知，乳蛋白与EGCG共价复合后，乳蛋白的表面疏水性指数显著降低。
[0044] 实施例3:
[0045] 取实施例1中的四种乳蛋白和四种乳蛋白-EGCG共价复合物，用10mM的磷酸钠缓冲 液(pH= 7.0)分别配制成0.02-0.3mg/mL的蛋白溶液;将lmL蛋白溶液加入到3mL的ABTS溶 液，室温避光反应60min后，在734nm波长处测定其吸光值。比较样品与水溶性维生素 E (Trolox)清除ABTS自由基的能力，以Trolox当量(nmol TE/g干基)表示样品清除ABTS自由 基的能力，测定结果如表3所示。
[0046] 表3:乳蛋白和乳蛋白-EGCG共价复合物的ABTS自由基清除能力的比较
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[0048]注:上述表格中ABTS自由基清除能力的单位为nmol TE/g干基。
[0049]从表3可知，乳蛋白-EGCG共价复合物的ABTS自由基清除能力显著强于对应的乳蛋 白。
[0050] 实施例4:
[0051] 将β-胡萝卜素油悬浮液(0.15g)溶解于中链甘油三酸酯(MCT)中，加热至140°C，搅 拌至完全溶解，形成胡萝卜素的浓度为5g/L的油相;将α-乳白蛋白-EGCG共价复合物加入 到50mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中，溶胀过夜，形成α-乳白蛋白-EGCG共价复合物