一种抗菌带鱼四肽及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从带鱼蛋白中分离出的抗菌肽，属于氨基酸提取工艺领域。
【背景技术】
[0002] 抗菌肽是生物体内的小分子多肽，是构成生物体先天免疫系统的重要成分。抗菌 肽具有广谱抗菌及抗病毒等特性，细菌对抗菌肽比传统抗生素更难产生抗性，是传统抗生 素的理想替代品。目前已从各种生物中分离出了逾2000种抗菌肽。鱼类种类繁多，生境复 杂，是抗菌肽的重要来源，目前已报道了 150余种鱼源抗菌肽。刘超(基于酶法制备鲶鱼抗菌 肽纯化试验，食品工业，2014)利用酶法水解鲶鱼体表黏液蛋白制备抗菌肽，对大肠杆菌的 抑菌效果较好。他采用20%~60%饱和度的硫酸铵沉淀，3卯1161(1616-25凝胶过滤层析对 抗菌肽进行分离提纯。并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电（SDSPAGE)对分离纯化的效 果进行了检验。检测出该抗菌肽分子量为27.7 ku，抑菌率达到2.9%。然而，上述工艺比较 复杂，制备研究还只能停留在实验室阶段，很难产业化实施。
[0003] 鱼类是抗菌肽分离制备的重要来源。鱼我国是水产大国，带鱼产量高，然而，目前 为止，还仍未对水产酶解制抗菌肽展开广扩的研究，对于优质蛋白含量高的带鱼的蛋白的 分离和提取，未曾有相关文献记载。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种新的抗菌肽--带鱼四 肽；
[0005] 本发明的另一目的是提供上述带鱼四肽的制备方法。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：
[0007] -种抗菌带鱼四肽，氨基酸序列为Gln-Ala-Glu-Gly。抗菌带鱼四肽的编码基因如 序列表中序列1所示，抗菌带鱼四肽如序列表中序列2所示。
[0008] 优选的，上述抗菌带鱼四肽的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 1)带鱼预处理
[0010]带鱼去头，去内脏，清洗后用匀浆制成肉浆，用水漂洗、离心脱脂，沉淀物冷冻干 燥，得到脱脂带鱼蛋白，-20°C保存备用；
[0011] 2)酶法水解带鱼蛋白制得带鱼四肽
[0012]将步骤1)得到的脱脂带鱼蛋白溶于水中，形成质量分数3%的带鱼蛋白溶液，再调 pH值7.0，水浴振荡30 min后加入碱性蛋白酶开始水解，水解过程中控制溶液pH值维持8.5; 水解4h，灭活后冷冻离心，去除上清中微量油脂及沉淀，将中间部分清液真空浓缩；
[0013] 3)超滤分离
[0014] 在0.25 MPa压力下超滤，依次透过分子质量为10KD，5KD，3KD的超滤膜；得到〉 10KD，10KD~5KD，5KD~3KD，〈3KD四个不同分子量段组分，将〈3KD的组分真空浓缩，冷冻干 燥；
[0015] 4)凝胶过滤层析
[0016] 用SephalexG25色谱柱，加步骤3)中分离的溶液2mL，以pH 7·5,0·15 mol/L的磷酸 缓冲液作为洗脱液，以流动相溶液为10mL/h的流速进行洗脱，洗脱后有4个组分，经抗菌实 验检测后得到第一个组分的抗菌活性最强，收集第一个组分的流出相真空浓缩，冷冻干燥； [0017] 5)RP_HPLC 分离提纯
[0018]利用XBrigeTMPrep-C18柱将步骤4)的组分进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下： [0019] 色谱柱为XBrigeTMPrep_C18、250 _Χ4·6 _、5μηι色谱柱。流动相A:甲醇溶液，流 动相Β: 0.05mol/L磷酸二氢钠溶液;洗脱方式:梯度洗脱，A: Β = 5:95;流速：1.0ml/min;柱 温:25°C ;进样量：10ul;运行时间：15min;紫外检测波长:254 nm;
[0020] 所述流动相中的磷酸二氢钠的PH为7.25，所述梯度洗脱的程序为〇11^11451^114 15min-95min，甲醇 10%-30%-65%-95%。
[0021] 优选的，所述步骤1)中，所述肉浆:水的体积比为1:4;进一步优选的，所述水为蒸 馏水；
[0022] 优选的，所述步骤1)中，所述匀浆于高速分散均质机中进行。
[0023] 优选的，所述步骤1)中，用水漂洗30min后4000r/min下离心脱脂15min。
[0024] 优选的，所述步骤2)中，用5mol/L HC1溶液调pH值7.0;用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HC1溶液调节溶液pH值维持8.5。
[0025] 优选的，所述步骤2)中，碱性蛋白酶的加入量为2000U/g，酶解温度为45°C，水解完 成后，90°C灭活10 min。
[0026] 优选的，所述步骤2)中，所述冷冻离心过程具体为于4°C下12000 r/min冷冻离心 30 min；
[0027] 优选的，所述步骤2)中，所述真浓缩过程具体条件为于旋转蒸发器40°C下真空浓 缩。
[0028]优选的，所述步骤3)中，膜分离条件是：带鱼肽水溶液质量分数30%，pH7.5，温度 35。。。
[0029]优选的，所述步骤4)和步骤5)中，真空浓缩的条件均为40°C下浓缩60min，冷冻干 燥的条件均为-50 °C下冷冻24h。
[0030] 本发明提供了一种新的抗氧化肽一带鱼四肽，具有很强的抗菌活性，本发明所得 带鱼四肽滤过液的抗菌活性达85.2%，抗氧化活性达77.8%。对金黄色葡萄球菌的最小抑 菌浓度(MIC)为0.20 mg/ml，对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度(MBC)为0.26mg/ml。本发明 带鱼四肽制备方法简单，只需一步水解即可，水解条件温和，纯化过程简单，适何扩大化的 工业化生产。其中，水解过程是采用碱性蛋白酶水解，水解度为69.52 %，羟自由基清除率为 76.74%。
【附图说明】
[0031] 图1是凝胶过滤层析分离四个组分；
[0032]图2是半制备RP-HPLC分离提纯F1组分的色谱图；
[0033]图3是半制备RP-HPLC分离提纯F1组分4个部分的抑菌圈照片(浓度0.5mg/ml); [0034]图4是组分F1-1的分子量报告图。
【具体实施方式】
[0035]以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0036] 实施例1:
[0037]为了说明本发明的实质，申请人进行了如下实验。
[0038]仪器与设备
[0039] U-2800紫外分光光度计，日本日立有限公司；PHS-3C pH计，上海兰科仪器公司； FJ300SH数显高速分散均质机，上海隆拓仪器设备有限公司；UPT-11-60L优普超纯水机，杭 州雷琪实验器材有限公司。
[0040]试验方法 [0041 ] 1、带鱼预处理
[0042]带鱼去头，去内脏，清洗后立即用高速分散均质机匀浆，用蒸馏水(体积比1:4)漂 洗30min后4000 g离心脱脂15min，沉淀物冷冻干燥，得到脱脂带鱼蛋白，-20°C保存备用。 [0043] 2、酶法水解脱脂带鱼蛋白
[0044]用碱性蛋白酶水解脱脂带鱼蛋白。
[0045] 具体方法如下：
[0046]将脱脂带鱼蛋白用水溶解，得质量分数3%的蛋白溶液，用5mol/L HC1溶液或 5mol/LNa0H溶液调pH值7.0，水浴振荡30 min后加入碱性蛋白酶(加酶量为2000U/g)开始水 解。反应过程中用0.1111〇1/1似0!1或0.1111 〇1/1!1(：1溶液调节溶液?!1值维持8.5。酶解温度 45°C，水解4h，90°C灭活10 min后于4°C12000g冷冻离心30 min，去除上清中微量油脂及沉 淀，将中间部分清液于旋转蒸发器40 °C真空浓缩。
[0047]带鱼碱性蛋白酶水解产物的水解度为69.52%，羟自由基清除率为76.74%。
[0048] 3、超滤分离
[0049]在0.25 MPa压力下超滤，透过分子质量为3ku超滤膜。最佳膜分离条件是：带鱼肽 质量分数30 %，pH7.5，温度3