Oct4在调控IL-31基因表达中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学及基因工程领域，具体涉及0ct4在调控IL-31基因表达中 的应用。
【背景技术】
[0002] 白细胞介素 31(Interleukin 31，IL-31)是由Dillon等于2004年发现的具有4个螺 旋结构的多肽链细胞因子，归类于白细胞介素 6细胞因子家族，主要由活化的CD4+Th2细胞产 生。人的IL-31基因位于12q24.31，含有904bp，开放阅读框为495bp，编码一条由164个氨基 酸残基组成的多肽链，成熟的IL-31蛋白质含有141个氨基酸。IL-31通过与IL-31RA和0SMRi3 两个亚基组成的异源二聚体复合物结合，从而激活JAK-STAT、MAPK、PI3K/AKT三条信号通 路，发挥生物学功能。IL-31的受体主要分布于上皮细胞、淋巴细胞、支气管和皮肤等组织 中，所以目前关于IL-31的研究主要集中于IL-31在皮肤炎症反应中的作用。
[0003] 0ct4又称为0ct3或0ct3/4,属于P0U转录因子家族中的成员，由Pou5fl基因编码， 主要在胚胎干细胞及生殖干细胞中表达，维持胚胎干细胞的自我更新和多分化潜能。人 0ct4基因位于第6号染色体上(6p21.31)，含有16.41^)。0(^4具有不同的亚型（Isoforms)，其 中Isoform 1是具有功能的0ct4亚型，具有5个外显子，4个内含子，翻译的蛋白质含有一个 保守的DNA结合结构域(P0U结合域），能与含八聚体基序(Octamer motif)的DNA结合从而调 控下游靶基因的转录。目前关于0ct4的靶基因研究的比较多，大多数是多分化潜能有关的 基因，如:Nanog和Sox2等。在细胞分化的过程中0ct4的表达逐渐下调，在完全分化的细胞中 基本检测不到0ct4的表达，然而最近发现很多成体干细胞也表达0ct4。间充质干细胞 (Mesenchymal stem cel Is，MSCs)是成体干细胞中的一种，来源于多种组织，如:骨髓、脐带 和脂肪组织等。最近很多文章报道0ct4也能促进MSCs的自我更新和多向分化潜能，但其分 子调控机制目前还不清楚。在MSCs中0ct4可以直接调控其靶基因 MBD6、Dnmtl和CD49f等的 表达，从而促进MSCs的自我更新和多向分化潜能。但0ct4是否对IL-31基因表达起调控作用 目前还不清楚。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供0ct4在调控IL-31基因表达 中的应用。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现:0ct4在调控IL-31基因表达中的应用，该技 术方案的提出是基于本发明发明人首次发现转录因子0ct4在MSCs内对IL-31表达有调节作 用。
[0006] 所述的IL-31基因的核苷酸序列如下所示：
[0007] ATGGCCTCTCACTCAGGCCCCTCGACGTCTGTGCTCTTTCTGTTCTGCTGCCTGGGAGGCTGGCTGGCCTCCCACAC GTTGCCCGTCCGTTTACTACGACCAAGTGATGATGTACAGAAAATAGTCGAGGAATTACAGTCCCTCTCGAAGATGC TTTTGAAAGATGTGGAGGAAGAGAAGGGCGTGCTCGTGTCCCAGAATTACACGCTGCCGTGTCTCAGCCCTGACGCC CAGCCGCCAAACAACATCCACAGCCCAGCCATCCGGGCATATCTCAAGACAATCAGACAGCTAGACAACAAATCTGT TATTGATGAGATCATAGAGCACCTCGACAAACTCATATTTCAAGATGCACCAGAAACAAACATTTCTGTGCCAACAG ACACCCATGAATGTAAACGCTTCATCCTGACTATTTCTCAACAGTTTTCAGAGTGCATGGACCTCGCACTAAAATCA TTGACCTCTGGAGCCCAACAGGCCACCACTTAA〇
[0008] 所述的0ct4在调控IL-31基因表达中的应用，是0ct4蛋白能够与IL-31基因的启动 子特异性结合，并能够活化IL-31基因的转录。
[0009] 所述调控为正调控。
[0010]从而，所述的0ct4在调控IL-31基因表达中的应用，是将0ct4蛋白或是能表达0ct4 的核酸序列制备成活化IL-31基因转录的药物。
[0011] 所述的0ct4在调控IL-31基因表达中的应用，是将0ct4蛋白或是能表达0ct4的核 酸序列制备成治疗皮肤炎症的药物。
[0012] 所述的核酸序列为DNA序列。
[0013] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明是本发明首次发现转录因 子0ct4在MSCs内对其新靶基因 IL-31表达有调节作用而提出的。本发明采用染色质免疫共 沉淀和双荧光素酶报告基因系统方法证明了在MSCs内转录因子0ct4能够与IL-31基因的启 动子特异性结合，并能够活化IL-31基因的转录。本发明揭示了转录因子0ct4对其新靶基因 IL-31表达的调控机制，并为将0ct4和IL-31应用于皮肤炎症等疾病的治疗中奠定必要基 础。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明实施例1中将含有0ct4、sh0ct4和空质粒的慢病毒分别感染UC-MSCs 后采用RT-PCR方法确认IL-31表达的结果图。
[0015]图2是本发明实施例2中采用CHIP(染色质免疫共沉淀)方法证实在不同代数的UC-MSCs中，0c t4与IL-31基因的启动子DNA结合的结果图；其中，*P〈0.01相对于各自的对照抗 体;P3、P6、P9分别代表UC-MSCs培养传代至第3代、第6代、第9代。
[0016]图3是本发明实施例3中采用双荧光素酶报告基因系统检测0ct4在UC-MSCs中对 IL-31基因表达调控作用的结果图；其中，*P〈0.01相对于各自的空质粒的对照。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细描述，但不用来限制本发明的范 围。若未特别指出，实施例均参照常规实验条件，或者参照试剂盒制造厂商的说明书进行。 实施例中所用到的工程菌、细胞株均为商业化的菌株或细胞株。大肠杆菌感受态细胞的制 备按照《分子克隆》进行制备。
[0018] 实施例1采用RT-PCR方法确认转录因子0ct4对IL-31基因表达的影响。
[0019] (l)0ct4和sh0ct4慢病毒表达载体的构建。
[0020] l)0ct4基因引物的设计。
[0021]用Primer 5.0软件设计扩增0ct4基因开放阅读框的引物，引物两端酶切位点分别 为Xhol和Ncol，引物由上海生工生物有限公司合成，引物的序列如下：
[0022] 0ct4正向引物：5 ' -CCGCTCGAGAGGATGGCGGGACACCTGGCTT-3 '
[0023] 0ct4反向引物：5'-CATGCCATGGAAGGGCAGGCACCTCAGTTTG-3'。
[0024] 2)扩增 0ct4 基因。
[0025]以人胚胎干细胞的cDNA(购自上海斯丹赛生物技术有限公司）为模板扩增0ct4基 因。
[0026] PCR扩增的反应体系如下：
[0027]
[0028] PCR扩增的反应条件如下：
[0029]
[0030] 3)0ct4基因的回收。
[0031 ] 将上述PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用Gel Extraction Kit(Omega)对PCR 产物回收，实验步骤对试剂盒说明书略有改动，步骤如下：
[0032] A、用手术刀片切下含有目的DNA片段的琼脂糖胶，尽量切除DNA片段周围多余的琼 脂糖胶以减少凝胶体积。
[0033] B、将凝胶块置于1.5ml微量离心管中，加入与凝胶等体积的Binding buffer( X p2)。将混合物置于50-55 °C，7min，直到凝胶完全溶解。
[0034] C、将HiBind DNA离心柱置于随附的2ml收集管中，将700μ1 DNA/琼脂糖溶液加至 HiBind DNA离心柱，室温下，10，000 X g离心lmin。
[0035] D、弃去液体，将HiBind DNA离心柱重新放回相同的收集管。向HiBind DNA离心柱 中加入300μ1 Binding buffer(Xp2)，室温下，10,000Xg离心lmin，洗HiBind DNA离心柱。 弃去流出液并重新使用收集管。
[0036] E、加入700μ1无水乙醇稀释的洗涤缓冲液洗涤HiBind DNA离心柱。室温下10,000 X g离心 lmin〇
[0037] F、弃去液体并最大转速空柱离心2min以干燥离心柱基膜。
[0038] G、将HiBind DNA离心柱置于干净的1.5ml离心管。向离心柱基膜中间滴加 15-30μ1 洗脱缓冲液，室温放置lmin后以13，000g离心lmin洗脱DNA。
[0039] 4)0ct4基因表达载体的构建。
[0040] 将回收的0c t4DNA片段和pGL3-Bas i c真核表达载体(Promega公司）经过Xho I和Nco I双酶切处理，用T4DNA连接酶将双酶切后的0ct4DNA片段克隆至经双酶切的pGL3-Basic真 核表达载体中，然后转染大肠杆菌DH5a感受态细胞，使用正向引物和反向引物对克隆进行 筛选，将筛选得到的阳性克隆送去测序，DNA测序表明序列正确，命名为pGL3-〇ct4。
[0041 ] 5)0ct4慢病毒质粒的构建。
[0042] 使用Xhol单酶切pGL3-〇ct4及慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreenl (购买于汉恒生物 科技有限公司），使用T4DNA连接酶将经过Xhol单酶切后的0ct4DNA片段克隆入Xhol单酶切 线性化慢病毒转移质粒pLVX-IRES-ZsGreenl，然后转染大肠杆菌DH5a感受态细胞，通过限 制性内切酶Ncol单酶切初步鉴定重组质粒，将鉴定正确的克隆送上海生工生物有限公司进 行DNA测序，命名为pLVX-0ct4-Z SGreenl。将测序正确的克隆大量提取质粒以备转染用。
[0043] 6)sh0ct4慢病毒质粒的构建。
[0044] 在上海生工生物有限公司合成0ct4shRNA颈环结构对应的DNA序列（含有Xhol和 Ncol酶切位点），使用Xhol单酶切0ct4shRNA颈环结构对应的DNA序列及慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreenl，使用T4DNA连接酶将0ct4shRNA颈环结构对应的DN