一种抗vegfr2的单链抗体及其应用
【专利说明】一种抗VEGFR2的单链抗体及其应用
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种全新的可与血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR2)特异结合的高亲和力全人源单链抗体，能抑制VEGF诱导的血管内皮细胞(human umbilical vascular endothelialcell, HUVEC)的增殖，是一种具有抗血管生成活性的基因工程抗体。
【背景技术】
[0003]癌细胞在生长因子受体的激活下增殖，癌细胞生长时会促进自身促血管生长因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等的表达上调，刺激内皮细胞活化，分泌出其他血管生成所需要的蛋白酶，引起一系列的级联反应，通过抗凋亡等机制调节内皮细胞的存活，促进新生血管形成并维持其完整性。内皮细胞在VEGF等刺激因子作用下增殖，大量增殖的内皮细胞重新排列形成条索状，刺激成纤维细胞分泌细胞外基质，形成新的血管。人VEGF受体2( VEGFR-2)，又称为KDR(kinase insert domain-containing receptor，KDR)是VEGF的主要信号传导受体，其参与新生血管内皮细胞的迀移、增殖、生存，在肿瘤周围血管新生过程中具有重要的作用。因此，抑制VEGF/VEGFR-2途径是抑制肿瘤转移及生长的重要途径。
[0004]KDR作为一种酪氨酸激酶受体，由一个胞外结构域，一个跨膜结构域和一个胞质内酪氨酸激酶结构域组成，其胞外有7个胞外免疫球蛋白样区，其中3区(含有97个氨基酸)对VEGF的紧密结合部位贡献最为突出。前期工作中以KDR胞外3区(KDR3)为靶抗原，利用噬菌体展示技术从Griff in.1单链抗体库中筛选出了具有单链抗体。
【发明内容】
[0005]发明目的
本发明基于具有提高体外亲和力的单链抗体突变体库的构建，提供一种具有潜在医学和药学价值的全人源的抗KDR3的高亲和力单链抗体。
[0006]技术方案
一种抗血管内皮生长因子受体2的单链抗体，其特征在于:所述的重链的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，即ARRGDQWESGGBSSAAPRLRSCTTFFLCCCSRGDDD ;轻链为SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，即 LSPTSTTAPPFFTQQQSFGVQ。
[0007]上述的抗体选择性地与VEGFR-2结合或抑制VEGF与VEGFR-2的结合或中和VEGF。
[0008]所述的一种抗VEGFR2的单链抗体制备治疗以血管内皮生长因子受体的过量表达为特征的疾病药物中的应用，其中所述的疾病为癌症、视网膜黄斑病变和糖尿病并发眼部疾病。
[0009]有益效果: 本发明基于具有提高体外亲和力的单链抗体突变体库的构建，提供一种具有潜在医学和药学价值的全人源的抗KDR3的高亲和力单链抗体，获得单链抗体RD高亲和力和更强的抑制VEGF诱导的HUVEC细胞增殖的活性。本发明单链抗体的特征为特异性高亲和力结合人VEGFR-2胞外3区-KDR3，在体外能够抑制VEGF诱导的HUVEC细胞的增殖。
[0010]本发明得到对靶抗原KDR3亲和力提高的单链抗体RD，体外抑制HUVEC细胞增殖实验结果表明，本发明得到的单链抗体可以显著抑制HUVEC细胞的增殖。本发明为治疗以血管内皮生长因子受体的表达，特别是过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法，相关疾病包括但不限于癌症和视网膜黄斑病变等糖尿病并发眼部疾病。
[0011]
【具体实施方式】
[0012]以下借助非限制性实施例举详细描述本发明。对本领域技术人员而言，在不背离本发明精神的前提下对它所做的任何显而易见的改动，特别是对若干部件的等同替换，都构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。
[0013]实施例中涉及的百分比，其中固定试剂为重量体积百分比，液体试剂为体积百分比。
[0014]实施例1抗KDR3单链抗体突变体的筛选及鉴定
以包被缓冲液(10mM Tris, NaCl 150mM, ρΗ9.0)稀释KDR3蛋白(按文献制备:JuanZhang, Haixin Li, Wei Chen.Preparat1n of Extracellular Domain 3 of HumanVEGF Receptor-2 and the Monitoring of Its Real-Time Binding to VEGF byB1sensors.B1technol.Prog., 2009, Vol.25，N0.6)至 100 yg/ml;取4 ml加入到免疫管中，4 °C包被过夜；次日，弃上清，PBS迅速洗管3次；2% MPBS(含有2%脱脂牛奶的PBS )，37 °C封闭2 h;弃封闭液，用I3BS迅速洗管3次;噬菌体展示库(1012?1013 p.f.u )(购自天津赛尔生物技术有限公司)悬浮于4 ml 2% MPBS并加入到免疫管中，室温反复倒转30min后，于室温静置90 min以上；以含有0.1% Tween-20的PBS洗管10次，再以I3BS洗管10次去除去污剂；加入I ml 100 mM三乙胺(700 μ? 7.18 mol/L三乙胺加入50 ml水中)，室温反复倒转孵育10 min，进行特异性洗脱;0.5 ml I M Tris(pH7.4)用于迅速中和洗脱下来的噬菌体；中和后的噬菌体用于感染对数期的E.coli TGl，进行扩增和制备，用于下一轮筛选，连续进行四轮筛选。四轮筛选中KDR3包被的浓度分别为5yg/ml，5yg/ml，2.5yg/ml，lyg/ml ο
[0015]任意挑取取第四轮筛选获得的噬菌体感染200μ1处于对数生长期的感染琥珀突变型蛋白表达菌株Ε.coli HB2151(Novagen公司)，lmM的IPTG于30°C诱导过夜，进行抗体ELISA筛选亲和力高的单链抗体。方法如下:酶标板包被lyg/ml的KDR3，每孔100μ1。4°C包被过夜，5%的脱脂奶粉封闭，37°C封闭2h。将制备得到的上清中的不同种类的抗体各100μ1加入到对应的孔中。一抗为1:2 000稀释的鼠源抗c-Myc抗体，二抗为1:5000稀释HRP标记的山羊抗鼠抗体，加入TMB显色液显色30min后，每孔加入50μ1 I mol/ L H2SO4终止反应，酶标仪测定0D450/0D650作为最后检测结果。
[0016]实施例2抗KDR3单链抗体的可溶性表达及分离纯化
挑选实施例1抗体ELI SA初步检测值最高的菌株，37 °C培养至0D600=0.8，加入终浓度ImM的IPTG，30°C诱导过夜，取样进行15% SDS-PAGE，分析目的蛋白表达。
[0017]将过夜菌液6000rpm，4°C离心15min，收集菌体;PBS重悬洗涤菌体一次，采用渗透休克法破碎菌体，即高渗溶液(50mM Tris-HCl，20%蔗糖，ImM EDTA，pH8.0)重悬菌体，缓慢搅拌1min A°C , 9000g离心1min，倒出上清，用冰冷的5mM MgS(k重悬沉淀，缓慢搅拌10min，4°C，1000g离心20min，将上清与上一步上清合并用于镍柱(购自GE Healthcare)亲和层析纯化，用不同浓度的咪唑洗涤杂蛋白，洗脱目的蛋白；15% SDS-PAGE检测收集的样品，-20°C保存目的蛋白，命名为单链抗体RD，经上海生工氨基酸测序获知，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2，。
[0018]实施例3 ELISA测定相对亲和力
方法同实施例2初步检测亲和力ELISA。将KDR3溶解在0.05 mo I/L碳酸缓冲液(pH9.6)中，终浓度为I yg/ml，每孔100 μ?将抗原加到96孔板中，4 °C包被过夜。5%的脱脂奶粉封闭2h。分别加入4000，3000，2000，1000，500，250 nM/ml 的RD抗体，37°C孵育90min，用PBST洗三次，每次5 min。一抗为1:2 000稀释的鼠源抗c_Myc抗体，二抗为1:5 000稀释HRP标记的山羊抗鼠抗体。加入TMB显色液显色30分钟后，每孔加入50μ1 I mol/ LH2SO4终止反应，酶标仪测定0D450/0D650作为最后检测结果。显示抗体RD对抗原有较高的亲和力，抗体效价为1:2500。
[0019]实施例4单链抗体AK11对HUVEC细胞的生长抑制作用
HUVEC细胞(购自上海生化与细胞所)于37°C、5%C02培养箱中培养，待长满90%以上时，换液。将重悬后的细胞稀释至3 X 14细胞/ml，96孔板中每孔加ΙΟΟμΙ，同时设置空白对照组(即不含细胞，只加培养基)，于37°C、5%C02培养箱中培养24h后加待测物。用DMEM+1%FBS培养基将 RD 稀释到:5000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、lOng/ml。每孔 100μI，每个浓度设置三个平行孔(n=3)，同时设置空白对照和阴性对照(无VEGF)，VEGF终浓度为10ng/ml。最后于37°C、5%C02培养箱中培养72h。
[0020]培养72h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液12μ1，于培养箱中继续培养4h。然后于平板离心机中，3000 rpm离心5min后，吸出孔中溶液，加入150μ1 /孔DMSO溶液，再于微量振荡器上振荡I Omin，最后酶标仪上检测570nm和630nm处的吸光度值，则每个孔的吸光度值即为A570-A630。
[0021 ]抗体对VEGF诱导的内皮细胞抑制率计算公式为:(A?4-A^)/(A|^-A空)X 100%。
[0022]结果，在本实验条件下，单链抗体RD的IC50值为18.45nM，其具有外抗血管内皮细胞增殖的活性。
【主权项】
1.一种抗VEGFR2的单链抗体，其特征在于:所述的重链可变区域的氨基酸序列为SEQID NO:1;轻链可变区域为SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的一种抗VEGFR2的单链抗体制备治疗以血管内皮生长因子受体的过量表达为特征的疾病药物中的应用，其中所述的疾病为癌症、视网膜黄斑病变和糖尿病并发眼部疾病。
【专利摘要】本发明公开了一种经过体外亲和力成熟的全人源的抗KDR单链抗体RD，具体为一种抗血管内皮生长因子受体2的单链抗体，其特征在于：所述的重链可变区域的氨基酸序列为SEQ？ID？NO:？1；轻链可变区域为SEQ？ID？NO:？2的氨基酸序列。本发明的单链抗体可特异性结合于血管内皮生长因子受体2，可以抑制VEGF诱导的HUVEC的生长，可应用于治疗以血管内皮生长因子受体的表达，特别是过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法，相关疾病包括但不限于癌症和视网膜黄斑病变等糖尿病并发眼部疾病。
【IPC分类】A61P35/00, A61P27/02, A61P3/10, C07K16/28, A61K39/395
【公开号】CN105601743
【申请号】CN201610068209
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年2月1日