黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法
【专利说明】黑曲霉(Aspergi I I us n i ger )An_1 9菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术微生物领域，涉及I株液体发酵生产Lovastat in的黑曲霉(Aspergillus niger)An_19菌株、用途和发酵生产方法。
【背景技术】
[0002]黑曲霉(Aspergillusniger)是在自然界广泛存在的一种丝状真菌，属半知菌门、丝抱纲(Hyphomycetes)、丛梗抱目(Moniliales)、丛梗抱科(MoniIiaceae)。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，生长适宜pH为3?7。是重要的工业发酵菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。也是美国食品药品监督局(FDA)认定的GRAS(Generally Regarded As Safe)菌株之一，在有机酸、工业酶制剂方面应用广泛。此外有些菌株还会产生具有重要应用价值的生理活性物质如Lovastatin 等。
[0003]1980年，Alberts等从土曲霉(Aspergillus terreus)中提取到称为洛伐他汀(Lovastatin)的化合物。Lovastat in是降血脂的他汀类药物，具有抑制体内生物合成胆固醇的关键酶-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG)的活性，可用于治疗心血管疾病。美国和日本等国家通过发酵的方式开发出一系列的Lovastatin药物，但我国对降脂曲霉的研究生产中普遍存在产量偏低、生产成本偏高等问题。究其原因主要是缺乏优良的生产菌株和适宜的发酵工艺。因而筛选出高产Lovastat in的曲霉菌株并对其发酵工艺进行优化，具有良好的理论意义和应用前景。
[0004]本发明所筛选的黑曲霉(Aspergillus niger)An_19菌株，具有高产Lovastatin、生长速度快、培养方法简单等优良特性。在发酵培养基初始PH为5.5，培养温度为26 0C条件下，An-19菌株通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，5 L发酵罐发酵116 h,Lovastatin产量可达267.02 mg/Lo
【发明内容】
[0005]针对市场上Lovastatin需求日益增长，生产Lovastatin优良工业菌株的缺乏等的问题。本发明的目的是提供I株高产Lovastatin黑曲霉(Aspergillus niger)An_19菌株和发酵生产Lovastat in的方法。
[0006]本发明所述黑曲霉(Aspergillus niger)An_19菌株，保藏编号为:CCTCC M2015673，保藏地为:中国典型培养物保藏中心，中国武汉大学。保藏日期为:2015年11月11曰。
[0007]黑曲霉(Aspergillus niger)An_19菌株的形态特征:PDA培养基上的菌落初期为白色绒毛状，后变成黑褐色粉粒状，15 d菌落直径达60 mm，有环形沟纹;显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径6讓?8 Mi的分支状;分生孢子头丰富，黑褐色，球状，直径150 μπι?350 μm;分生孢子梗茎长短不一，壁较薄，光滑黄褐色;顶囊膨大成球形，双层小梗;分生孢子呈褐色球形或近球形，表面粗糙，直径4?5 μπιX 4~4.5 μπι。
[0008]黑曲霉An-19菌株用于产生洛伐他汀(Lovastatin)的应用。黑曲霉An-19菌株的发酵培养条件为PH 5.0~6.0，温度20~30°(:。
[0009]本发明所涉及的An-19菌株筛选自自然发酵的稻谷，经形态特征和18SrDNA基因序列分析，鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。经培养基配方和培养条件优化后，5 L发酵耀发酵 116 h，Lovastatin产量可达267.02 mg/Lo
[0010]高产洛伐他汀(Lovastatin)的发酵方法，其特征在于该方法包括以下的步骤:
1)用接种针挑少量该菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养2?4d;
2)取平皿中I菌饼接种于H)培养液中，摇床培养2?4d，制得一级种子；
3)在种子培养液中，按种子培养液质量2?10%加入一级种子，摇床培养I?3d成二级种子；
在发酵培养基中，按发酵培养基质量10?20%接入二级种子，发酵培养时间为110 h~120
h0
[0011]作为优选，发酵培养条件为pH 5.0~6.0，温度20~30°(:。
[0012]作为优选，发酵培养的发酵罐搅拌桨转速200r/min，通气量120 L/h，罐压0.1MPa~0.5 MPa。
[0013]作为优选，一级种子培养基:马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%,KH2PO4 0.2%，MgSO4.7H20 0.1%、pH 5.5?6.0。
[0014]作为优选，二级种子培养基:乳糖10%、甘油1%、蛋白胨0.5%、KH2P04 0.1%,MgSO4.7H20 0.1%、NaN03 0.1%、ρΗ 5.5?6.0。
[0015]作为优选，发酵培养基:乳糖18%、甘油2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、MgS04.7H20
0.1%,NaNO3 0.2%^KH2PO4 0.l%、ZnS〇4 0.2%、pH 5.5。
[0016]取上述制得发酵液10 mL，加甲醇40 mL(按1:4的比例)，超声处理20 min，50°C水浴2 h,3000 r/min离心3 min，取上清液，经0.45μηι滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，可达220 mg/L~ 270 mg/L。黑曲霉(Aspergillus niger)An_19菌株5 L发酵罐发酵 110 h~120 h后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中Lovastatin，与滤液混合；用远藤章教授方法提取Lovastatin，蒸干后得微黄色块状晶体;核磁共振波谱技术分析比对表明Lovastatin提取物结构与Lo vas tat in标准品一致。
[0017]黑曲霉在食品生产中已获得了长期的实践证明，其生产和应用均不存在安全隐患，An-19菌株可用于Lovastatin的生产，是较有潜力的工业菌株。
【附图说明】
[0018]图1 An-19菌株PDA培养基上培养15 d菌落正面。
[0019]图2 An-19菌株PDA培养基上培养5 d分生孢子头生长的显微特征(100 X)。
[0020]图3 An-19菌株分生孢子头显微特征(呈球状，200 X)。
[0021 ]图4 An-19菌株分生孢子显微特征(400 X)。
[0022]图5An-19菌株 18S rDNA基因序列(1302 bp)。
[0023]图6基于16株曲霉属(Aspergillus)18S rDNA基因序列建立的An_19菌株系统发育树。
[0024]图7 An-19菌株在5 L发酵罐中的生长曲线和Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。
[0025]图8 An-19菌株发酵液中Lovastatin提取物外观(10 X)。
[0026]保藏声明
黑曲霉(Aspergillus niger)An_19菌株，保藏编号为:CCTCC M 2015673，保藏地为:中国典型培养物保藏中心，保藏日期为:2015年11月11日。
【具体实施方式】
[0027]下面对本发明【具体实施方式】做一个详细的说明。
[0028]实施例1黑曲霉(AspergiIIus niger)An_19菌株的筛选和鉴定 I培养基
①PDA培养基:马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2.0%，水I L，pH 5.5?6.0。用于曲霉菌株的分离纯化和鉴定。
[0029]②PD培养基:马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、水I L，pH 5.5?6.0。用于高产Lovas tat in曲霉菌株的筛选。
[0030]实验方法
2.1曲霉菌株的分离纯化
从不同生境收集的自然发酵样品表面挑取少量菌丝接入TOA培养基平板表面，26 °C培养24 h，待白色绒毛状菌丝长出后，取少许菌丝转接于另一PDA培养基平板上继续培养3 d产生孢子后，显微镜观察具有曲霉的典型特征，挑取少许边缘菌丝纯化3次，得性状均一的曲霉纯菌株。将分离纯化获得的曲霉菌株编号保存于25%甘油中，置于4 °C冰箱备用。
[0031 ] 高产Lovastatin曲霉菌株的筛选
用高效液相色谱法(HPLC)检测曲霉各菌株发酵液中Lovastatin产量进行筛选。曲霉各保存菌株26°C PDA平板培养3 d后，用打孔器取I菌饼(直径0.8 mm)转接种于PD培养液中，260C ^200 r/min摇床培养7 d。取发酵液I mL，加甲醇4 mL(按1: 4的比例)，超声处理20min，50°C水浴2 h,3000 r/min离心3 min，取上清液，经0.45μηι滤膜过滤，利用HPLC法检测Lovastat in产量，筛选高产Lovastat in的曲霉菌株。色谱条件:Agi lent Prep_C18液相色谱柱，波长:λ = 237 nm。
[0032]菌株的鉴定
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