一种薄荷多倍性的鉴定方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明具体涉及一种薄荷(Mentha haplocalyx Briq.)多倍性的鉴定方法。
【背景技术】
[0002]薄荷(Mentha haplocalyx Briq.)为唇形科薄荷属多年生草本植物，全草入药，用于治疗风热感冒、风温初起、头痛、目赤、喉痹、咽喉肿痛、口舌生疮、牙痛、荨麻疹、风疹等等，其茎、叶中所含的挥发油被广泛地应用于食品、医药、化妆品、香料、烟草等工业。中国是世界公认的薄荷主产国，江苏省为薄荷的道地产区，但长年栽培的很多品种都出现了严重退化，鲜草和薄荷油产量下降的情况。多倍体有很多二倍体所没有的优势性状，如植株的巨大性、抗性增加、有机合成速率加快及克服远源杂交不育性。发展薄荷的多倍体育种技术有利于薄荷优良品种的选育。然而，薄荷是传统中药，栽培历史悠久，经过多年的人工选育和自然选择其遗传背景已经相当复杂，在进行多倍体育种前需要先摸清加倍实验材料的倍性基础。
[0003]传统的倍性鉴定方法包括形态鉴定法，多倍体具有生长缓慢，发育迟缓，花期推后等特性。因此，整个生长期均可以外部形态特征来判断，这是初步鉴定是否为多倍体的最简单、最直观的方法。但无法准确鉴定具体倍性。细胞学鉴定法，例如对植株花粉母细胞的染色体数目进行技术观察，由于薄荷具有唇形科植物特征的轮伞花序，花小进行花粉母细胞的培养非常困难因此也不易使用。流式细胞分析仪测定法是目前最快速且有效的鉴定细胞倍性的方法而。但其原理是根据DNA含量测定，再通过比较DNA含量来推断细胞的倍性。因此需要首先明确对照植株倍性才能比较出检测株系倍性。通过检测分生旺盛的器官、组织的染色体数目来进行鉴定，这是最直接、最准确的一种鉴定法。这种方法切实可行，广泛应用于倍性鉴定。但这一方法也往往因取材、观察视野和技术误差等因素影响结果的准确性。利用该方法进行倍性研究前需要对所取分裂旺盛部位进行预实验和观察对分裂时期有所把握才能完成鉴定。作者曾利用不定根尖压片方法进行过薄荷属植物染色体观察研究(薄荷属植物染色体观察，江苏农业科学，2009年第4期，190页)但经过观察该方法所得到的具有有丝分裂相细胞少，处于分裂中期可用于染色体观察的细胞数目更难发现，并且根尖细胞结构致密，分散难度大，解离后敲片时间长技术难度高不易于掌握和大量样本的分析。
【发明内容】
[0004]本发明针对传统现有技术的不足之处，提供了一种薄荷多倍性鉴定的方法为了该植物倍性育种提供技术支持。
[0005]为了达到上述目的，本发明提供了一种薄荷多倍性鉴定的方法，包括如下步骤:
(I)分生组织准备:
选取当年生植株叶片作为外植体，冲洗干净后，进行消毒;切取0.5X0.5 cm大小，将其接种于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，培养温度为18-24 °C，首先在黑暗中培养24 h，然后进行正常培养15-20 d;所述正常培养条件为:温度18-24 °C，光照强度为1600-2000 Ix光照时间为8-10 h/d,;所述诱导培养基为MS培养基并添加激素2，4-D和KT;所述诱导培养基中2，4-D浓度为1.0-6.0 mg/L，KT浓度为0.5-1.0 mg/L;将得到的薄荷叶片切口边缘愈伤组织切割后接入继代增殖培养基中进行继代培养25-35 d，培养温度为20-26°C，光照时间为10-16 h/d，光照强度为1600-2000 Ix;所述继代增殖培养基为MS培养基并添加激素2，4-D和KT;所述继代增殖培养基中2，4-D浓度为2.0-4.0 mg/L，KT浓度为1.0-2.0 mg/L；
(2)分生组织的处理:取步骤(I)中增殖旺盛的愈伤组织，切割后浸泡于含有0.1-0.2%秋水仙素溶液中2-6 h后取出，蒸馏水清洗表面溶液后用乙醇-冰醋酸浓度比(3:1)固定液固定24 h后取出蒸馏水清洗表面溶液；充分清洗至无味后用2.5%混合酶液酶解室温下2-4h;蒸馏水洗去酶液后于新鲜蒸馏水中浸泡30min;
(3)分生组织细胞压片:取步骤(2)中处理后的愈伤组织于载玻片上用镊子将其压碎，去除大块残碎材料，加入改良的苯酚品红溶液染色后将载玻片在酒精灯上加热，染色完成后用45%醋酸溶液分色，加上盖玻片后用镊子轻敲盖片使细胞分散均匀；
上述诱导培养基、继代增殖培养基中均含有琼脂6.0-7.0g/L、蔗糖25-35g/L，且pH值为5.6-5.8。
[0006]对于本发明的进一步改进在于，步骤(I)中选择的叶片为近茎尖的第1、2节上叶片。所述消毒过程为:将清洗干净的外植体置于稀释30倍的84消毒液中振荡消毒15分钟，流水冲洗20-30分钟后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒60-90秒，用无菌水洗涤3次后置于
0.1%的升汞中消毒10分钟，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5分钟。
[0007]步骤(2)中所取愈伤组织为继代培养基上生长8-15d的新生增值细胞团。浸泡于含有0.1-0.2%秋水仙素溶液中3-5小时最佳浸泡温度为0-4°C ；步骤(3)中最佳染色时间为10-15min。
[0008]本发明一种薄荷多倍性鉴定的方法具有以下优点:
1、以在继代增殖培养基中继代生长了8-15d愈伤组织细胞团为分生组织为细胞观察对象时，细胞处于时期为对数生长的快速分裂期，因此细胞团中处于有丝分裂时期细胞比例高，可观察染色体数目的处于有丝分裂中期相细胞数目多，易于在显微镜下观察和寻找，能够减少显微镜下寻找合适分裂相的时间，提高观测效率。
[0009]2、植物生长调节剂2，4_D和KT组合诱导得到的愈伤组织结构松散，在去除材料预处理中HCl解离步骤后，同样能获得很好的细胞分散效果，即为制片节省时间，同时易于压片和敲片从而获得分散较好的单层细胞，易于观测和操作。
[0010]3、染色时间短，染色清晰，图片背景色浅易于染色体计数。
【附图说明】
[0011]图1、2分生组织形态颜色。
[0012]图3、4倍性观察结果图。
【具体实施方式】
[0013]实施例丨、薄荷2个主栽品种‘687 ’及‘沪-39 ’的倍性鉴定:
1、分生组织准备: 选取当年薄荷品种‘687’、‘沪-39’近茎尖的第1、2节上叶片置于稀释30倍的84消毒液中振荡消毒15 min，流水冲洗30 min后，于无菌操作台上用75 %乙醇消毒90 S，用无菌水洗涤3次后置于0.1 %的升萊中消毒10 min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5 min。切割为
0.5X0.5 cm长的小块，将其正面朝上接种于含有2，4-D浓度为1.5 mg/L和KTl.5 mg/L诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，培养温度为20±2 °C，首先在黑暗中培养24 h，然后进行正常培养15 d;正常培养条件下光照时间为10-16 h/d，光照强度为1600-2000 Ix;经15 d诱导培养后的愈伤组织切割成面积约为0.5cm2的小块，接入含增殖含2，4-D浓度为3.0 mg/L，KT浓度为2.0 mg/L的MS培养基中；继代增殖培养基中进行继代培养25天，培养温度为20±20C，光照时间为10-16小时/天，光照强度1600-2000 Ix;培养基中均含有琼脂6.0 g/L、蔗糖25 8/1，且?!1值为5.8。
[0014]2、分生组织的处理:
将在继代增殖培养基上培养10天的嫩黄色或白色生长旺盛细胞团挑出，切割后浸泡于含有0.1%秋水仙素溶液中4°C处理5小时后取出，蒸馏水清洗表面溶液后用乙醇-冰醋酸浓度比(3:1)固定液固定24h，取出蒸馏水清洗表面溶液;充分清洗至无味后用2.5%混合酶液酶解室温下2-4h;蒸馏水洗去酶液后于新鲜蒸馏水中浸泡30min。
[0015]3、分生组织细胞压片:
将挑选的细胞团组织浸泡处理后置于载玻片上，压碎，将大块残碎材料除去，加入改良的苯酚品红溶液染色10 min后将载玻片在酒精灯上加热，染色完成后用45%醋酸溶液分色，加上盖玻片后用镊子轻敲盖片使细胞分散均匀后即可用显微镜观察。
[0016]结果表明:薄荷品种‘ 687，倍性为2n=96、‘沪-39，2n=96。
【主权项】
1.一种薄荷多倍性鉴定的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)分生组织准备: 选取当年生植株叶片作为外植体，冲洗干净后，进行消毒;切取0.5X0.5 Cm大小，将其接种于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，培养温度为18-24 °C，首先在黑暗中培养24 h，然后进行正常培养15-20 d;所述正常培养条件为:温度18-24 °C，光照强度为1600-2000 Ix光照时间为8-10 h/d，；所述诱导培养基为MS培养基并添加激素2，4-D和KT;所述诱导培养基中2，4-D浓度为1.0-6.0 mg/L，KT浓度为0.5-1.0 mg/L;将得到的薄荷叶片切口边缘愈伤组织切割后接入继代增殖培养基中进行继代培养25-35 d，培养温度为20-26°C，光照时间为10-16 h/d，光照强度为1600-2000 Ix;所述继代增殖培养基为MS培养基并添加激素2，4-D和KT;所述继代增殖培养基中2，4-D浓度为2.0-4.0 mg/L，KT浓度为1.0-2.0 mg/L； (2)分生组织的处理:取步骤(I)中增殖旺盛的愈伤组织，切割后浸泡于含有0.1-0.2 %秋水仙素溶液中2-6 h后取出，蒸馏水清洗表面溶液后用乙醇-冰醋酸浓度比(3:1)固定液固定24 h后取出蒸馏水清洗表面溶液；充分清洗至无味后用2.5%混合酶液酶解室温下2-4h;蒸馏水洗去酶液后于新鲜蒸馏水中浸泡30min; (3)分生组织细胞压片:取步骤(2)中处理后的愈伤组织于载玻片上用镊子将其压碎，去除大块残碎材料，加入改良的苯酚品红溶液染色后将载玻片在酒精灯上加热，染色完成后用45%醋酸溶液分色，加上盖玻片后用镊子轻敲盖片使细胞分散均匀； 上述诱导培养基、继代增殖培养基中均含有琼脂6.0-7.(^/1、蔗糖25-358/1，且?!1值为5.6-5.8。2.根据权利要求1所述薄荷多倍性鉴定的方法，其特征在于:所述步骤(2)中所取叶片正面朝上放在培养基上。3.根据权利要求1所述薄荷多倍性鉴定的方法，其特征在于:增殖旺盛的愈伤组织为继代培养基上生长8-15d的新生增殖细胞团。4.根据权利要求1所述薄荷多倍性鉴定的方法，其特征在于:所述步骤(2)中所取新生增殖旺盛的愈伤组织为嫩黄色或白色松散愈伤组织。5.根据权利要求1所述薄荷多倍性鉴定的方法，其特征在于:所述步骤(2)中浸泡于含有0.1%-0.2 %秋水仙素溶液中2-6 h小时浸泡温度为0-4°C。6.根据权利要求1所述薄荷薄荷多倍性鉴定的方法，其特征在于:所述步骤(3)中用改良的苯酚品红染色时间为10-15min。
【专利摘要】本发明设计一种薄荷多倍性的鉴定方法，选取当年生植株叶片作为外植体，诱导愈伤组织作为观察材料，对其进行前处理，染色压片后显微计数，鉴定倍性。本发明确定了用于倍性观察的分生组织的培养与选择方法及压片处理方法。该方法简便有效，细胞易于分散、有丝分裂中期相细胞比例高易于寻找，有利于染色体的分散。适合于薄荷这种染色体数目多、型态小的倍性复杂植物。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N5/04
【公开号】CN105602886
【申请号】CN201510948998
【发明人】于盱, 梁呈元, 亓希武, 房海灵, 李维林
【申请人】江苏省中国科学院植物研究所
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年12月18日