一种底物特异性提高的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体及制备方法

文档序号:9838500阅读:640来源:国知局
一种底物特异性提高的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体及制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种底物特异性提高的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体及其制备方法, 属于基因工程和酶工程领域。
【背景技术】
[0002] 漆酶(1&(:(^%3.(:.1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶,能催化酚类物质的氧化还 原反应,在木质素及其前体类似物的生物降解中发挥重要作用。漆酶的氧化底物极为广泛, 包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等,因此漆酶应用潜力巨大。 在木材加工领域,漆酶能代替化学胶合剂,不但能提高产品质量,而且能减轻对人体健康的 伤害及对环境的污染;在造纸工业中,漆酶用于纸张生物漂白和制浆,可减少制浆造纸厂的 污染,有助于造纸业最终实现清洁生产;在食品加工领域,漆酶可用于除去果汁中酚类化合 物引起的混浊,从而提高果汁的质量。此外,漆酶还可氧化氯酚及其衍生物,降低其毒性,减 少以氯酚类为工业原料生产染料、防腐剂、除草剂、杀虫剂等化工产品而造成的环境污染。
[0003] 漆酶按来源不同可分为三大类:植物漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。细菌漆酶包括芽 胞杆菌属的CotA蛋白、海单胞菌的PpoA蛋白、大肠杆菌的CueO蛋白、灰色链霉菌的EpoA蛋白 等,与真菌及植物漆酶蛋白结构相似,都具有4个铜离子结合位点。
[0004] 本实验室前期已从自行筛选的短小芽胞杆菌菌株W3(Bacillus pumilus W3)中克 隆并重组表达了CotA漆酶,研究发现该CotA漆酶相对其它种类漆酶具备以下优点:碱性pH 下酶活性高、耐高温且热稳定性好、能耐受高浓度有机溶剂及卤素离子环境等,这些优良特 性正是目前漆酶在印染废水处理领域进行工业化应用所急需的。然而,野生短小芽胞杆菌 CotA漆酶天然表达量很低,且底物专一性差,酶活性偏低,成为工业化应用的瓶颈。因此本 发明利用基因工程和酶工程手段,提高短小芽胞杆菌CotA漆酶对特定底物的专一性,进一 步提高其工业化应用前景。

【发明内容】

[0005] 本发明提供了一种短小芽胞杆菌漆酶突变体,该突变体以本实验室前期构建的 pColdll-CotA质粒为模板,将野生型漆酶第417位甘氨酸(Gly,G)突变为亮氨酸(Leu,L),随 后以野生型CotA漆酶为对照,验证该突变体对底物2,2_联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺 酸)二铵盐(ABTS)是否具有更高专一性。
[0006] 所述B.pumilus CotA漆酶的亲本氨基酸序列与NCBI数据库中的B.pumilus CotA 漆酶氨基酸序列一致(由本实验室提交,GenBank登录号:KF040050)。
[0007] 所述突变体是将野生型CotA漆酶氨基酸序列中的第417位的Gly突变成了Leu,命 名为G417L。
【附图说明】
[0008] 图1:野生短小芽胞杆菌CotA漆酶三维模拟结构图
[0009] 图2:野生短小芽孢杆菌CotA漆酶及突变体纯酶SDS-PAGE电泳图。注1:野生型CotA 漆酶纯化条带;2: G417L突变体漆酶纯化条带;Μ:蛋白分子量标准
[0010] 图3:构建突变体质粒过程的分子操作原理示意图
【具体实施方式】
[0011] 在本发明中所使用的术语,除非有另外说明,一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。
[0012] 下面结合具体的制备实施例和应用实施例,并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解,这些实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。
[0013] 在以下的实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0014] 实施例1野生短小芽胞杆菌CotA漆酶的表达与纯化。
[0015] 从甘油管接种前期构建的重组表达菌株CotA/pColdII/BL21(DE3)于LB液体培养 基(含100mg/L氨节青霉素)过夜培养,按2 %接种量将种子接入LB液体发酵培养基(含 100mg/L氨苄青霉素)。大肠杆菌在37°C培养2h后,加入0.2mM终浓度的IPTG进行诱导,并在 15°C摇床继续发酵培养26h后,将发酵液于4°C、8000rpm离心10min去除上清,收集菌体。将 收集的菌体用磷酸盐缓冲液重悬,重悬后用超声波细胞破碎仪将菌体破碎释放胞内蛋白, 破碎完成后,将破碎的液体于4°C、8000rpm离心10min收集上清。收集的上清用于CotA漆酶 蛋白纯化。
[0016] 由于重组表达的CotA漆酶蛋白带有多聚组氨酸标签(His6. tag),因此使用镍离子 亲和层析方法分离目标蛋白。镍离子亲和层析纯化步骤:(1)平衡:用10倍柱体积的20mM缓 冲液(含5mM的咪唑)平衡HisTrap HP镍离子柱(lmL);(2)上样:预先处理好的样品以lmL/ min的流速上样;(3)洗脱:用高浓度咪唑进行梯度洗脱,收集洗脱条件下峰型对应的管号, 并做酶活检测。最终获得纯化好的野生型CotA漆酶。
[0017] 实施例2CotA漆酶突变体构建并制备
[0018] (1)定点突变
[0019]以前期构建的含有B.pumilus CotA漆酶基因的重组质粒pColdll-CotA为模板,将 漆酶中第417位的甘氨酸(Gly)突变成亮氨酸(Leu),命名为G417L。
[0020]引入G417L突变的定点突变引物为:
[0021 ]正向引物5'-CGTTAACCCAACAAGG0;CACACACCCTAT-3'(下划线为突变位点)
[0022]反向引物5'-座CCTTGTTGGGTTAACGATGTTCCATACC-3'(下划线为突变位点)
[0023] 利用上述引物,以重组质粒pColdll-CotA为模板,进行PCR反应。反应均在50yL体 系中进行,反应条件为:95°C预变性3min,随后进行25个循环(95°C20s,57°C20s,72°C 6min),循环后72°C延伸7min,最后4°C保温。取10yL PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测。检 测到有目的产物后加 lyL DMI1酶于剩余的PCR产物中,混匀,37°C孵育1小时。将孵育处理后 的产物全部经1%琼脂糖凝胶电泳分离、切胶,用凝胶回收试剂盒回收目的片段。回收的目
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