Cyp3a5基因的检测引物组、其构成的反应体系及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种CYP3A5基因的检测引物组、其构成 的反应体系及应用。
【背景技术】
[0002] 细胞色素 P450 (cy tochromeP450或CYP450)简称CYP450，主要存在于肝脏、肠道中 的单加氧酶，是人体内参与内源性物质和外源性化合物代谢过程的一组超家族酶类，尤其 在药物的体内代谢过程中扮演重要角色。其中，CYP3A5参与他克莫司、咪达唑仑、氨苯砜、可 的松、尼菲地平等多种药物的代谢。该基因的一个3即，^776746(0￥?345*3,69864>6)，会导 致CYP3A5基因的mRNA过短地剪切，形成一个"不完整的"CYP3A5蛋白，从而导致CYP3A5酶蛋 白活性的降低甚至消失。
[0003] 据统计，CYP3A5*3等位基因在中国人群中出现的频率约为75%，而携带突变型等 位基因的患者在临床药物治疗过程中的表现与野生型携带者大相径庭。例如，在临床器官 移植术后使用的主要免疫抑制剂类药物他克莫司（tacro 1 imus，FK506)，其代谢过程主要由 CYP3A5进行调控。如果CYP3A5基因出现突变，则会导致病人体内他克莫司的血药浓度大幅 度增高，并出现肾毒性、神经毒性、高血压和胃肠道紊乱等一系列药物毒副作用。因此，在临 床中检测CYP3A5基因分型对于临床治疗，特别是器官移植术后病人的临床用药治疗实现个 体化安全用药具有重要的指导作用。
[0004] 目前，关于CYP3A5基因分型的检测多采用荧光定量PCR，基因测序以及基因芯片等 技术手段。CN 104498592 A公开了一种人CYP3A5基因检测方法，包括提供待测样品、核酸 扩增体系和荧光检测体系混合物;通过扩增反应循环扩增靶多核苷酸;使荧光发生基团与 被扩增的靶多核苷酸序列间接结合;测定荧光量;所述核酸扩增体系至少分别包含CYP3A5 基因 CYP3A5*1和CYP3A5*3多态性的特异性正向引物和反向引物。使用这些方法进行CYP3A5 基因分型检测均不同程度存在购买仪器成本高，操作程序复杂，检测周期较长等问题，不利 于提高检测效率并实现临床推广普及。然而，从目前来看，这种检测需求又非常巨大，因此， 寻找一种高效且价格容易被患者接受的检测手段，对于CYP3A5基因分型检测有着重要的现 实意义。
[0005] 环介导的等温扩增(LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等温扩增技术， 其主要特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)的作用下进行恒温扩增，仅需15-90分钟即可产生109-101()数量级的产物。具有 敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易于判定的优点。
【发明内容】
[0006] 本发明为了克服上述方法的缺陷，提供一种CYP3A5基因的检测引物组、其构成的 反应体系及应用，所述检测体系具有敏感性高、特异性好和操作简便等优点。
[0007] 为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：
[0008]第一方面，本发明提供一种CYP3A5基因的检测引物组，所述检测引物组如下：
[0009]正向外侧引物F3A:SEQ ID N0:1:ATTATGGAGAGTGGCATAGG;
[0010] 反向外侧引物B3A:SEQ ID N0:2:TTAGGGTGTGACACACAG;
[0011] 正向内侧引物FIPA:SEQ ID N0:3: TTTAAAGACAAAAGAGCTCTTTAAAGAGAAGATACCCA CGTATGTACCA；
[0012] 反向内侧引物BIPA:SEQ ID N0:4:TGGTCATGGGTAATATGCTTCGTGGTAAGAAAGCCCCAA TGGTACT；
[0013] 正向外侧引物F3G:SEQ ID N0:5:GAGTGGCATAGGAGATACC;
[0014] 反向外侧引物B3G:SEQ ID N0:6:TTAGGGTGTGACACACAG;
[0015] 正向内侧引物FIPG:SEQ ID N0:7:CTTAAAGACAAAAGAGCTCTTTAAAGAACGTATGTACCA CCCAGC；
[0016] 反向内侧引物BIPG:SEQ ID N0:8:CCTGTTTGGACCACATTACCCCMGAGTCTCACACAGGAG。
[0017] 优选地，所述SEQ ID从)：1-4所示的序列是用于检测^776746位点的4等位基因。
[0018] 优选地，所述SEQ ID从):5-8所示的序列是用于检测^776746位点的6等位基因。 [0019]本发明中，4条引物的外侧引物记为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3，内侧引物 记为正向内侧引物FIP和反向内侧引物BIP，其中FIP包含了 Flc和F2，BIP包含了 Blc和B2,上 述引物均由在线软件PrimerExplorer V4设计。本发明在普通LAMP的基础上，以特异性要求 最严格的Flc的5'端针对rs776746位点设计等位基因特异引物，分别检测rs776746的A等位 基因和rs776746的G等位基因。通过分别在FIPA和FIPG的5'端第三位引进额外突变，进一步 降低非特异性扩增的可能性。
[0020]第二方面，本发明提供一种检测CYP3A5基因的反应体系，所述反应体系包括第一 方面所述的引物组，反应缓冲液，dNTPs，羟基萘酚蓝，甜菜碱，Bst DNA聚合酶，待检样品基 因组DNA和去离子水。
[0021 ]优选地，所述反应缓冲液包括Tris-HCl，KC1，（NH4)2S〇4，MgS〇4和Tween-20。
[0022] 优选地，所述Tris-HCl 的浓度为 10-30mM，例如可以是 10mM、llmM、12mM、13mM、 15禮、161111、181111、2〇1111、22111]\1、23111]\1、25111]\1、261111、281111或3〇1111，优选为15-251111，进一步优选为 20mM〇
[0023] 优选地，所述 KC1 的浓度为 10-60mM，例如可以是 1 OmM、1 ImM、12mM、15mM、18mM、 20禮、231111、25111]\1、3〇111]\1、351111、4〇1111、451111、5〇1111、51111]\1、52111]\1、531111、541111、551111或6〇1111，优选为 50-55mM，进一步优选为50mM。
[0024] 优选地，所述(NH4) 2 S〇4 的浓度为 5-13mM，例如可以是 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、1 OmM、 1 ImM、12mM或13mM，优选为8-12mM，进一步优选为10mM〇
[0025] 优选地，所述 MgS〇4 的浓度为 2-8mM，例如可以是 2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mMS8mM， 优选为2_6mM，进一步优选为4mM。
[0026] 优选地，所述Tween-20的体积分数为0 · 1-1 %，例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、 0·4%、0·5%、0·6%、0·7%、0·8%、0·9%或1%，优选为0.1%。
[0027]优选地，所述dNTPs的浓度为 1 -2mM，例如可以是ImM、1. ImM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、 1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM 或2mM，优选为 1.2-1.8mM，进一步优选为 1.4mM。
[0028] 优选地，所述羟基萘酚蓝的浓度为108-130μΜ，例如可以是108μΜ、109μΜ、110μΜ、 111卩]?、1124]\1、1154]\1、1164]\1、1184]\1、12(^]\1、1224]\1、1254]\1、1264]\1、1284]\1或13(^]\1，优选为115-123μΜ，进一步优选为120μΜ。
[0029] 优选地，所述甜菜碱的浓度为0.1-謂，例如可以是0.謂、0.21、0.41、0.61、0.81或 1Μ，优选为0.5-0.8Μ，进一步优选为0.8Μ。
[0030] 作为优选技术方案，所述反应体系包括反应体系Α和反应体系G，其中每个25yL反 应体系含有以下组分：
[0031] 缓冲液： Tns-HCl 20 mM KC1 50 mM (NH4)2S04 10 mM MgS04 4mM Tween-20 0.1 % (体积分数） dNTPs 1.4 mM 羟基萘酚蓝 120 μΜ
[0032] 甜菜碱 （18Μ F3A/F3G 0.4 μΜ B3A/B3G 0.4 μΜ FIP4/F IPG 1 6 μΜ ΒΙΡ?/BIPG 1.6 μΜ BstDHA聚合酶 8U 待检测样品基因组 0 j-4 :ng￥L _上|务/'水加全25μL。
[0033] 第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的反应体系的使用方法，所述方法包 括如下步骤：
[0034] 将反应体系A和反应体系G所需各组分混合完毕，放置于恒温水浴锅进行反应，反 应后升温进行灭活处理，再根据体系颜色变化判定结果。
[0035] 优选地，所述恒温水浴锅的温度为55-68°(：，例如可以是55°(：、56°(：、57°(：、58°(：、59 °C、60°C、61°C、62°C、63°C、64°C、65°C 或68°C，优选为58-61°C，进一步优选为60°C。
[0036] 优选地，所述反应时间为15_90min，例如可以是15min、20min、25min、30min、 35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85mir^90min，tfci￡ 为45_90min，进一步优选为60min。
[0037] 优选地，所述升温后的温度为78-90 °C，例如可以是78°C、79°C、80°C、81°C、82°C、 83°(：、84°(：、85°(：、86°(：、87°(：、88°(：、89°(：或90°(：，优选为80-85°(：，进一步优选为80°(：。
[0038] 优选地，所述升温后的反应时间为15_30min，例如可以是15min、16min、17min、 18min、19min、20min、22min、25min、26min、28mir^30mind;i^*18-26min，?-步优选为 20min〇
[0039] 优选地，所述根据体系颜色变化判定结果为：
[0040] 反应体系A为紫罗兰，反应体系G为天蓝色，则待测位点基因型为GG;
[0041] 反应体系A为天蓝色，反应体系G为紫罗兰，则待测位点基因型为AA;
[0042] 反应体系A为天蓝色，反应体系G为天蓝色，则待测位点基因型为AG。
[0043] 第四方面，本发明提供一种检测CYP3A5基因的检测试剂盒，所述试剂盒包含如第 二方面所述的反应体系。
[0044] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0045] (1)步骤简单:扩增DNA只需反应体系配置完毕后放置在恒温水浴锅中进行反应扩 增即可，不需要预先进行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退火、延伸