一种链霉菌中聚酮生物合成基因簇及其扩增引物与试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物基因工程领域，具体涉及一种链霉菌中聚酮生物合成基因簇及 其扩增引物与试剂盒。
【背景技术】
[0002] 链霉菌是一类来源于土壤的革兰氏阳性细菌，它可以产生丰富的次级代谢产物， 可广泛应用于人、畜及农业抗生素、抗真菌剂等方面，对人类具有重要的应用价值。作为一 类重要的工业微生物，关于它的研究越来越受到重视。随着链霉菌基因工程技术的发展，克 隆次级代谢产物生物合成基因、鉴定合成基因的功能，并有目的地定向改造基因、在基因水 平改变菌种的生产能力日益成为研究的热点。由于链霉菌次级代谢产物生物合成基因的重 要作用，所以从不同的链霉菌菌株中进行生物合成基因的克隆具有重要的实际意义。链霉 菌次级代谢产物生物合成基因通常是成簇排列的，包含很多相关功能基因，这些基因对抗 生素产量具有很大影响。
[0003] 链霉菌次级代谢过程中，部分存在聚酮类化合物生物合成基因簇，是以羧酸缩合 反应形式进行的。如红霉素 （Streptomyces erytheara)和制霉菌素 （Streptomyces noursei)产生菌中均含有聚酮类化合物生物合成基因簇。武夷菌素是由不吸水链霉菌武夷 变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)产生的一种生物农药，具有高效、广 谱、低毒的特点，在生态农业和绿色食品生产中得到了广泛的应用。武夷菌素的生产是利用 培养不吸水链霉菌武夷变种，通过生物深层发酵产生的微生物的次生代谢产物。研究武夷 菌素的合成基因，对于基因工程育种提供了重要的理论基础，对于提高新菌株的开发与创 制水平具有重要的作用。但是，由于链霉菌本身GC含量很高，容易形成发夹结构，多基因的 克隆难度较大。因此，筛选高效、特异、灵敏的特异性引物对于基因簇的克隆是十分必要的。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种用于扩增聚酮生物合成基因簇的成套引物。
[0005] 本发明提供的成套引物，由引物对1 -引物对44组成；
[0006] 所述引物对1由序列1所示的引物和序列2所示的引物组成；
[0007] 所述引物对2由序列3所示的引物和序列4所示的引物组成；
[0008] 所述引物对3由序列5所示的引物和序列6所示的引物组成；
[0009] 所述引物对4由序列7所示的引物和序列8所示的引物组成；
[0010] 所述引物对5由序列9所示的引物和序列10所示的引物组成；
[0011]所述引物对6由序列11所示的引物和序列12所示的引物组成；
[0012] 所述引物对7由序列13所示的引物和序列14所示的引物组成；
[0013] 所述引物对8由序列15所示的引物和序列16所示的引物组成；
[0014] 所述引物对9由序列17所示的引物和序列18所示的引物组成；
[0015] 所述引物对10由序列19所示的引物和序列20所示的引物组成；
[0016]所述引物对11由序列21所示的引物和序列22所示的引物组成；
[0017]所述引物对12由序列23所示的引物和序列24所示的引物组成；
[0018]所述引物对13由序列25所示的引物和序列26所示的引物组成；
[0019]所述引物对14由序列27所示的引物和序列28所示的引物组成；
[0020] 所述引物对15由序列29所示的引物和序列30所示的引物组成；
[0021] 所述引物对16由序列31所示的引物和序列32所示的引物组成；
[0022]所述引物对17由序列33所示的引物和序列34所示的引物组成；
[0023] 所述引物对18由序列35所示的引物和序列36所示的引物组成；
[0024] 所述引物对19由序列37所示的引物和序列38所示的引物组成；
[0025] 所述引物对20由序列39所示的引物和序列40所示的引物组成；
[0026]所述引物对21由序列41所示的引物和序列42所示的引物组成；
[0027]所述引物对22由序列44所示的引物和序列44所示的引物组成；
[0028] 所述引物对23由序列45所示的引物和序列46所示的引物组成；
[0029] 所述引物对24由序列47所示的引物和序列48所示的引物组成；
[0030] 所述引物对25由序列49所示的引物和序列50所示的引物组成；
[0031] 所述引物对26由序列51所示的引物和序列52所示的引物组成；
[0032] 所述引物对27由序列53所示的引物和序列54所示的引物组成；
[0033] 所述引物对28由序列55所示的引物和序列56所示的引物组成；
[0034] 所述引物对29由序列57所示的引物和序列58所示的引物组成；
[0035] 所述引物对30由序列59所示的引物和序列60所示的引物组成；
[0036] 所述引物对31由序列61所示的引物和序列62所示的引物组成；
[0037]所述引物对32由序列63所示的引物和序列64所示的引物组成；
[0038] 所述引物对33由序列65所示的引物和序列66所示的引物组成；
[0039] 所述引物对34由序列67所示的引物和序列68所示的引物组成；
[0040] 所述引物对35由序列69所示的引物和序列70所示的引物组成；
[0041]所述引物对36由序列71所示的引物和序列72所示的引物组成；
[0042]所述引物对37由序列73所示的引物和序列74示的引物组成；
[0043]所述引物对38由序列75所示的引物和序列76所示的引物组成；
[0044]所述引物对39由序列77所示的引物和序列78所示的引物组成；
[0045] 所述引物对40由序列79所示的引物和序列80所示的引物组成；
[0046]所述引物对41由序列81所示的引物和序列82所示的引物组成；
[0047]所述引物对42由序列83所示的引物和序列84所示的引物组成；
[0048] 所述引物对43由序列85所示的引物和序列86所示的引物组成；
[0049] 所述引物对44由序列87所示的引物和序列88所示的引物组成。
[0050]本发明另一个目的是提供用于扩增聚酮生物合成基因簇的PCR试剂。
[0051 ]本发明提供的PCR试剂，包括上述的引物对、PCR扩增缓冲液(KOD plus Buffer)、 DMSO、dNTP、MgS〇4和DNA聚合酶(KOD plus酶）。
[0052] 上述PCR试剂中，所述引物对中每条引物中的摩尔比为1:1。
[0053] 含有上述的引物对或上述的引物对的试剂盒也是本发明保护的范围。
[0054] 上述的引物对或上述的引物对的试剂盒在扩增聚酮生物合成基因簇中的应用也 是本发明保护的范围。
[0055] 上述的引物对或上述的引物对的试剂盒在检测待测链霉菌中是否含有聚酮生物 合成基因簇中的应用也是本发明保护的范围。
[0056] 上述应用中，检测待测链霉菌中是否含有聚酮生物合成基因簇的方法包括如下步 骤:提取待测链霉菌的基因组DNA，分别用表2所示的44个引物对进行PCR扩增，得到44个片 段;再用DNAMAN软件将这44个片段拼接，若拼接得到序列89所示的聚酮生物合成基因簇，则 待测链霉菌中含有序列89所示的聚酮生物合成基因簇;若无法拼接得到序列89所示的聚酮 生物合成基因簇，则待测链霉菌中不含有序列89所示的聚酮生物合成基因簇。
[0057] 上述中，所述聚酮生物合成基因簇由如下1)-5)共5类成套基因组成：
[0058] 1)负责聚酮长链骨架合成的成套基因:wysI、wysJ、wysK、wysA、wys!^PwysC ;
[0059] 2)编码调控子的成套基因 wysR、wysRII、wysRIII、wysPI、wysPII和wysPIII;
[0060] 3)编码ABC转运蛋白的成套基因:wysG和wysH;
[0061] 4)编码糖基的合成与附着的成套基因:wysDI、wysDII和wysDIII;
[0062] 5)编码其他后修饰蛋白与未知功能蛋白的成套基因：wysL、wysM、wysN、wysE和 wysF〇
[0063] 上述聚酮生物合成基因簇为如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
[0064] 1)序列表中序列89所不的DNA分子；
[0065] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；
[0066] 3)与1)限定的DNA分子具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。
[0067] 上述严格条件可为在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0068]本发明另一个目的是提供一种基因簇。
[0069]本发明提供的基因簇，由如下1)-5)共5类成套基因组成：
[0070] 1)负责聚酮长链骨架合成的成套基因:wysI、wysJ、wysK、wysA、wys!^PIwysC ;
[0071 ] 2)编码调控子的成套基因 wysR、wysRII、wysRIII、wysPI、wysPII和wysP