转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法
【技术领域】
[00011本发明涉及基因工程技术，特别涉及一种转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚 酸含量的方法。
【背景技术】
[0002]心脑血管疾病是目前威胁全人类健康与生命的"头号杀手"。据统计，全世界每年 大约有1700万人死于心脑血管疾病，约占全球总死亡人数的1/3,我国每年大约有300万人 死于心脑血管疾病，因此，积极研究高效、低毒和廉价的治疗心脑血管疾病的临床药物对提 高人类健康水平具有十分深远的意义。
[0003] 丹参(Salvia miltiorrhiza)，为唇形科(Labiatae)鼠尾草属多年生草本植株，以 其干燥的根或块茎入药，被广泛地应用于治疗心脑血管疾病，是一种传统的中草药植株。丹 参的生物活性成分主要分为两大类:一类为水溶性的酚酸类化合物，主要包括丹酚酸A、丹 酚酸B、丹酚酸C、咖啡酸、迷迭香素、丹参素等；另一类为脂溶性的丹参酮类化合物，主要包 括丹参酮I、丹参酮ΠΑ、隐丹参酮、二氢丹参酮等。
[0004] 丹参中的丹酚酸在预防人类疾病方面发挥着重要的作用，其生物学活性主要包括 抗氧化、抗凝活性、肾脏功能的调节、肝脏的保护、心血管的保护、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎 症等。除此之外，丹酚酸还具有抗缺血再灌注、抗血栓、降血压和抗纤维化的作用。在中国， 丹参通常被制作为药剂，如片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂、口服液、喷雾、滴丸等，具有极高的 药用和经济价值。然而，在传统的栽培模式下，丹参长期栽培时品质退化严重、活性成分含 量降低、生长周期长及易受栽培区域和环境等制约;在化学合成过程中，丹酚酸的化学合成 过程十分繁琐，成本较高且易造成环境污染;在离体条件下通过细胞培养方法获得的细胞， 其药用活性成分积累量很低而且稳定性很差，远达不到商业化开发利用的要求。因此，为了 缓解具有重要临床需求的丹酚酸药源的紧缺性问题，亟待发明一种提高丹酚酸含量的新方 法，代谢工程的迅速发展与毛状根培养技术的日益成熟为提高丹参毛状根中丹酚酸成分的 含量，解决丹参酮药源紧缺性问题提供了 一条新思路。
[0005] 已有研究表明，植物中的R2R3-MYB转录因子广泛参与到植物的次生代谢过程，因 此挖掘丹参自身的R2R3-MYB转录因子来提高丹酚酸的含量具有重大的意义。利用基因工程 手段，将丹参转录因子SmMYB75基因遗传转化丹参叶片获得SmMYB75过表达的转基因丹参毛 状根，同时上调丹酚酸的生物合成，获得丹酚酸高产的丹参毛状根根系，为商业化生产丹酚 酸提供新型优质药源。目前尚未发现通过SmMYB75基因过表达策略提高丹参毛状根中丹酚 酸含量的相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的，就是为了克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种转SmMYB75基因 来提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法。
[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0008] 本发明从丹参中克隆得到645bp的SmMYB75基因，构建原核表达的载体，在大肠杆 菌中表达SmMYB75基因重组蛋白；定量PCR分析其在不同组织和甲基茉莉酸诱导后的基因的 表达量;构建亚细胞定位的载体，瞬时转化烟草叶片，激光共聚焦显微镜观察定量SmMYB75 基因在细胞中的定位情况;构建植物表达载体，发根农杆菌C58C1介导遗传转化丹参叶片获 得转基因的毛状根;PCR检测目的基因 SmMYB75的整合情况;定量PCR分析插入基因 SmMYB75 及丹酚酸生物合成相关基因在毛状根中的表达情况;高效液相色谱测定转基因毛状根中丹 酚酸的含量。
[0009] 一种转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，包括以下步骤：
[0010] (1)采用基因克隆方法从丹参中克隆获得基因 SmMYB75,所述的SmMYB75基因序列 如SEQ ID: 1所示，对其进行序列分析。
[0011] (2)根据丹参SmMYB75基因序列，把SmMYB75基因可操作性地构建于原核表达的载 体，在大肠杆菌中进行表达，重组蛋白进行SDS-PAGE电泳检测;所述的载体为pET-30a( + )， 大肠杆菌为菌株R〇setta(DE3)。
[0012] (3)根据丹参SmMYB75基因序列，设计定量PCR的引物，对SmMYB75在丹参的不同组 织中的表达量及其对甲基茉莉酸调控的诱导表达进行分析。
[0013] ⑷将SmMYB75基因构建于亚细胞定位的载体，转化根瘤农杆菌，进行烟草叶片的 瞬时转化，对SmMYB75基因进行亚细胞定位分析;所述的载体为pM0N530，根瘤农杆菌为菌株 Ase〇
[0014] (5)把SmMYB75基因可操作性地构建于表达调控序列，形成含SmMYB75基因的植物 表达载体;植物表达载体为经过改造获得的PCAMBIA2300+载体，包含CaMV35S启动子和终止 子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素抗性位点。
[0015] (6)将步骤(5)所得的含SmMYB75基因的植物表达载体转化发根农杆菌C58C1，获得 用于转化丹参的含SmMYB75基因植物表达载体的发根农杆菌菌株。
[0016] (7)利用步骤(6)所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为 阳性的转基因毛状根克隆;所述的经PCR检测的阳性转基因丹参毛状根是指:设计发根位点 基因 BrolB的上下游引物和在插入基因 SmMYB75内部及N0S终止子内部设计上游及下游特异 性引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的根系即为阳性转基因丹参毛状根根系。
[0017] (8)定量PCR测定步骤(7)获得的丹参转基因毛状根中SmMYB75基因及丹酚酸生物 合成途径相关基因的相对表达量，并筛选出过表达SmMYB75基因根系中SmMYB75基因的表达 量提高的根系;具体方法为:对PCR鉴定为阳性的毛状根克隆进行总RNA的提取，统一定量到 〇.5yg RNA，反转录成25μ1体系的cDNA，分别设计插入目的基因及看家基因 SmActin的定量 引物，以相同量的cDNA为模板进行定量PCR分析SmMYB75及丹酚酸生物合成相关基因的相对 表达量情况。
[0018] (9)高效液相色谱法测定步骤(8)中丹参转SmMYB75基因毛状根中丹酚酸的含量， 筛选丹酚酸含量显著提高的丹参转基因毛状根根系;所述的方法为:色谱柱C-18反相硅胶 柱，流动相为体积比30:70的乙腈和水，并用磷酸调节pH至2.03;检测波长281nm，柱温35°C， 流速lml/min，进样量20μ1。
[0019] 本发明综合应用生物学和基因技术方法如载体构建、遗传转化、分子检测、定量 PCR分析、丹酚酸的提取及含量测定等，发明了一种利用丹参的R2R3-MYB转录因子SmMYB75 基因提高丹参毛状根中丹酚酸的方法。本发明获得的过表达SmMYB75转基因丹参毛状根根 系中最高表达量为总丹酚酸含量为167.25mg/g干重，是对照组(73.7mg/g干重）的2.26倍。 本发明为商业化大量生产丹酚酸及降低药品价格提供了可能，也为大量生产丹酚酸临床药 物的大量需求提供了重要来源。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0021] 1、显著提高丹参毛状根中丹酚酸的含量。
[0022] 2、发明方法效果可靠。
[0023] 3、获取丹酚酸的成本低。
[0024] 4、生产过程无环境污染。
【附图说明】
[0025] 图 1 为pCAMBIA2300+: :SmMYB75载体构建示意图。
[0026] 图2为重组蛋白SmMYB75的SDS-PAGE分析。
[0027] 图3为丹参SmMYB75的组织表达分析。
[0028] 图4为丹参SmMYB75在甲基茉莉酸处理下的表达分析。其中，Control为乙醇对照组 诱导，MJ为甲基茉莉酸诱导。
[0029]图5为SmMYB75的亚细胞定位的分析结果图。GFP，绿色荧光蛋白；Bright，明场； Merged，绿色荧光蛋白与明场的合并图；pM0N530: :GFP，空载体荧光表达；pM0N530:: SmMYB75-GFP，SmMYB75的瞬时荧光表达。
[0030]图6为SmMYB75在转基因丹参毛状根中的表达分析结果图。其中，Control为C58C1 侵染获得的毛状根。
[0031]图7为丹酸酸生物合成相关基因的表达分析结果图。其中，Empty vector是空载 体。
[0032]图8为SmMYB75转基因丹参毛状根中丹酚酸的含量检测结果图。其中，Empty vector是空载体。
【具体实施方式】
[0033]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。图1为PCAMBIA2300+:: SmMYB75载体构建示意图。图2为重组蛋白SmMYB75的SDS-PAGE分析。
[0034] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆 (Sambrook等）中所述的条件，或按照制造厂商所提供的试剂或试剂盒所附带的说明书建议 的条件。
[0035] 实施例1
[0036] 丹参SmMYB75基因的克隆
[0037] 1 · 1 ·丹参总RNA的提取
[0038] 取少量丹参幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，然后按照TIANGEN公司提 供的RNAprep Pure Plant Kit使用说明书提取总RNA。用普通琼脂糖