蜂素信号肽介导鸡传染性支气管炎病毒n蛋白分泌表达的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种蜂素信号肽介导鸡传染性支气管炎病毒 N蛋白分泌表达的方法。
【背景技术】
[0002] 鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒 (Infectious bronchitis virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性的呼吸道疾病，主 要侵害鸡的呼吸系统、消化系统以及泌尿生殖系统等，不同日龄、品种的鸡群均易感。该病 自1930年在北美发现以后，陆续在其他各国发现，目前已经呈世界性流行趋势，给养禽业造 成巨大的经济损失。
[0003] 在IBV的4个结构蛋白中，N蛋白具有重要的生物学功能，它不仅与病毒RNA结合形 成核衣壳，参与病毒RNA的合成、转录和翻译，在病毒的复制中起到重要作用;而且还具有免 疫识别的相关抗原位点，能够诱导机体产生抗体和细胞免疫应答，在体液免疫和细胞免疫 均具有重要作用；另外，核蛋白在进化上相对保守，不同毒株之间具有广泛的交叉反应。因 此，N蛋白在新型疫苗的研究以及不同血清型的IBV抗体检测方面具有重要意义。
[0004] 昆虫杆状病毒表达系统作为四大表达系统之一，具有安全性高、对外源基因克隆 容量大、重组病毒易于筛选、具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力 等特点，已成功用于表达了近千种高价值蛋白，在很多领域都得到较广泛的应用。目前尽管 已有应用昆虫杆状病毒表达系统表达IBV的主要结构蛋白的研究，但这些研究有的表达蛋 白分子量小于天然蛋白，生物活性有限;有的表达蛋白分子量虽与天然蛋白大小基本一致， 有一定或良好的生物活性，但不能实现分泌性表达，增加了蛋白纯化的难度。因此，分泌表 达结构和功能接近于天然蛋白的IBV结构蛋白非常重要。而在已发表的利用昆虫杆状病毒 系统表达的IBV结构蛋白文章中，均存在表达量低，目的蛋白易被细胞内源性蛋白酶水解； 在细胞中目的蛋白以不可融的形式大量聚集，易丧失生物活性;难以纯化等问题。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种蜂素信号肽介导鸡传染性支气管炎病毒N蛋 白分泌表达的方法，以实现N蛋白高效、分泌表达且具有天然蛋白活性。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:蜂素信号肽介导鸡传染性支气 管炎病毒N蛋白分泌表达的方法，先获取融合蜂素信号肽的鸡传染性支气管炎病毒N基因 HBM-N，然后构建重组转移载体pFast-HBM-N和重组杆粒rHBM-N，最后将重组杆粒转染Sf9昆 虫细胞用于分泌表达鸡传染性支气管炎病毒N蛋白。
[0007] 获取融合蜂素信号肽的鸡传染性支气管炎病毒N基因HBM-N采用的N基因扩增引物 和蜂素信号肽的扩增引物分别为：
[0008] 上游引物N-F 5Z-CATTTCTTACATCTATGCGGATCGAATGGCAAGCGGTAAAGCAGCT-3'，
[0009] 下游引物N-R Y -CGGGGTACCTCAGTGATGGTGATGGTGATGGCCTTGAAAGTACAAGTTTTCAAG TTCATTCTCTCCAAGTGCTGAATCG-3 7 ；
[0010] 上游引物HBM-F S'-CCGCTCGAGATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTC-S'，
[0011] 下游引物HBM-R 5' -TCGATCCGCATAGATGTAAGAAATGTATACGACCATAAAAACAAGGGC-3'。
[0012] 上述蜂素信号肽介导鸡传染性支气管炎病毒N蛋白分泌表达的方法，包括以下步 骤：
[0013] (l)HBM-N 的获取
[0014] 对感染鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株的SPF鸡胚尿囊液进行总RNA抽提，反转录 获得cDNA，以cDNA为模板，采用上下游引物N-F和N-R进行PCR扩增，获得鸡传染性支气管炎 病毒N基因；再利用蜂素信号肽上下游引物HBM-F和HBM-R扩增出完整的蜂素信号肽HBM;然 后以蜂素信号肽和N基因为模板将两段基因进行融合，获得融合蜂素信号肽的基因HBM-N;
[0015] (2)构建重组转移载体pFast-HBM-N
[0016]将步骤⑴获得的目的基因HBM-N定向插入pFastBaC?Dual载体中，获得的阳性质 粒即为重组转移载体pFast-HBM-N;
[0017] (3)构建重组杆粒rHBM-N
[0018] 将步骤(2)获得的重组转移载体pFast-HBM-N转化DHlOBac?感受态细胞，通过Kan、 Tet、Gen三种抗生素，IPTG、X-gal蓝白斑筛选，挑取阳性菌多次划板获得纯化重组杆粒 rHBM-N；
[0019] (4)重组杆粒rHBM-N转染Sf9细胞
[0020]将重组杆粒rHBM-N利用脂质体介导转染Sf9细胞，用于分泌表达鸡传染性支气管 炎病毒N蛋白
[0021 ]针对现有昆虫杆状病毒系统表达IBV结构蛋白存在表达量低、天然生物活性不佳、 难以纯化等问题，根据昆虫细胞能识别和剪切的蜂素信号肽，能介导外源蛋白进行分泌表 达，提高目的蛋白的表达产量和增强表达蛋白的活性，发明人首次将昆虫细胞能识别和剪 切的蜂素信号肽引入昆虫杆状病毒系统中表达IBV主要结构蛋白，建立了一种蜂素信号肽 介导鸡传染性支气管炎病毒N蛋白分泌表达的方法，即先获取融合蜂素信号肽的IBV N基因 HBM-N，然后构建重组转移载体pFast-HBM-N和重组杆粒rHBM-N，最后将重组杆粒转染Sf9昆 虫细胞用于分泌表达鸡传染性支气管炎病毒N蛋白。研究表明，本发明通过在IBV N基因前 引入蜂素信号肽，实现了N蛋白高效、分泌表达，而且表达得到的IBV N蛋白具有良好的生物 学活性，减少了内源性蛋白酶的水解，利于纯化，为进一步研究N蛋白生物学功能、研制新型 诊断抗原和开发新型疫苗等奠定了基础，同时为IBV其它结构蛋白的表达提供了新思路。与 传统应用昆虫杆状病毒表达系统表达IBV结构蛋白方法相比，本发明具有以下优点：首次将 昆虫细胞能识别和剪切的蜂素信号肽引入昆虫杆状病毒系统中表达IBV N蛋白，使N蛋白获 得分泌表达。
【附图说明】
[0022] 图1是HBM-N融合基因扩增电泳图，其中Ml :DL2000DNA Marker; 1 :HBM-N融合产物； 2:未融合HBM的N基因产物;3: HBM信号肽扩增产物。
[0023] 图2是pEasy-HBM-N克隆载体的酶切鉴定图，M:DL15000DNA Marker;l:pEasy-HBM- N的Xho頂每切产物;2:pEasy-HBM-N的Xho I和Κρη頂每切产物;3:HBM-N PCR产物
[0024]图3是pFast-HBM-N克隆载体的鉴定图，M:DL15000DNA Marker;l:pFast-HBM-N的 Xho頂每切产物;2:pFast-HBM-N的Xho I和Κρη頂每切产物;3:HBM-N PCR产物
[0025] 图4是rHBM-N杆粒鉴定及其纯化图，M:DL10000DNA Marker;l:特异性引物鉴定；2: 空载体;3:M13通用引物鉴定。
[0026]图5是重组N蛋白的间接免疫荧光（IFA)鉴定图，A:感染重组杆状病毒rHBM-N; B:感 染空载体对照;C:正常细胞对照。
[0027]图6是重组N蛋白的Western-blot鉴定图，其中M:Blue Plus IV Protein Marker; 1:细胞上清；2:细胞上清和沉淀混合物；3:细胞沉淀;4:野生杆状病毒对照；5:正常细胞对 照。
【具体实施方式】
[0028]发明人根据GenBank中注册的鸡传染性支气管炎病毒中国分离株GX-YL5的N基因 序列设计一对引物，同时设计一对扩增蜂素信号肽的引物序列，通过生物学方法获得融合 蜂素信号肽的IBV N基因HBM-N，构建并鉴定重组转移载体pFast-HBM-N，构建并鉴定重组杆 粒rHBM-N，将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞，利用间接免疫荧光（IFA)和Western-blot鉴定表 明N蛋白获得了分泌表达。具体操作如下：
[0029] 1.1毒株
[0030] IBV毒株GX-YL5(GenBank NO.HQ848267.1)
[0031 ] 1 · 2方法
[0032] 1 .2. 1引物的设计：根据NCBI GenBank登录的GX-YL5N基因序列（登录号： FJ548847.1)设计扩增N基因的特异性引物N-F和N-R。
[0033] 上游引物N-F S'-CATTTCTTACATCTATGCGGATCGAATGGCAAGCGGTAAAGCAGCT-S'(序列 表SEQ.ID.No.l)，
[0034] 下游引物N-R Y -CGGGGTACCTCAGTGATGGTGATGGTGATGGCCTTGAAAGTACAAGTTTTCAAG TTCATTCTCTCCAAGTGCTGAATCG-3' (Kpn 1)(序列表SEQ. ID.No.2);
[0035] 根据参考文献设计扩增HBM信号肽上游引物和下游引物。
[0036] 上游引物HBM-F 5' -CCGCTCGAGATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTC-3' (Xho 1)(序列表 SEQ.ID.No.3)，
[0037] 下游引物HBM-R 5' -TCGATCCGCATAGATGTAAGAAATGTATACGACCATAAAAACAAGGGC-3' (序列表 SEQ.ID.No_4)。
[0038] N基因5'端与HBM 3'端存在25个互补碱基，利于获得融合HBM信号肽的HBM-N，HBM 信号肽5'端添加Xho頂每切位点，N基因3'端添加Κρη I酶切位点，在终止密码子前添加6 X His标签及TEV蛋白酶切位点，以便后期目的蛋白的鉴定和纯化;鉴定重组杆状病毒的Μ13通 用引物为：
[0039] M13F引物5' -CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'(序列表SEQ. ID.No.5)，
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