Enterobacter cloacae制备生物纳米单质硒的方法及应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及微生物应用、纳米单质硒合成及生物饲料添加剂领域，具体地，涉及利 用细菌合成生物纳米单质硒及其在猪上的应用。
【背景技术】
[0002] 硒是人和动物所必需的一种微量元素，对机体健康至关重要。缺硒会影响人体神 经系统、生殖系统、免疫系统和心血管系统功能，而畜禽动物缺硒则表现为生殖系统功能障 碍，繁殖性能下降，生长抑制，肌肉病变（白肌病，心肌和骨骼肌病)等。人和动物通过食物链 从土壤中获得硒以维持机体对硒的需求，而我国72%的土壤缺硒（< 0.6mg/kg)，平均有1亿 左右的人口因为硒摄取量不足而存在健康风险。目前公认的最安全、有效的补硒产品是硒 代蛋氨酸，而单质硒被认为是既没有活性也没有毒性的生物惰性硒形式。不过近年来研究 表明，与硒代蛋氨酸相比，纳米尺寸单质硒具有相当的生物活性和更低的毒性。
[0003] 纳米硒的制备大部分是利用抗坏血酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠和肼等还原剂，还原 二氧化硒、亚硒酸盐或硒酸盐来制得纳米硒。所得纳米硒易转变成灰黑色的具有毒性的单 质硒，一般需要加入表面活性剂或稳定剂才可维持理化性质。而且制备过程容易引入毒性 物质，危害生态环境。而已有研究表明，细菌可将硒氧化物还原为生物纳米单质硒，相对于 化学合成的纳米硒，这种由细菌合成的生物纳米单质硒形状规则，粒径均匀，稳定性强，此 外，细菌发酵不受季节、气候影响，生产能力强，生产周期短。所以，利用细菌制备生物纳米 单质硒可能是未来制备纳米硒的一种安全、高效的的方法。
[0004] CN104774875所公开的利用水生拉恩氏菌制备生物纳米硒的方法中，所涉及的菌 种分离自土壤，对葡萄根癌病具有防治作用，但将其转化得到的生物纳米单质硒直接应用 于人或动物，可能存在一定的风险。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明提供一种Enterobacter cloacae制备生物纳米 单质硒的方法及应用。
[0006] Enterobacter cloacae制备生物纳米单质硒的方法，以亚硒酸盐为原料，以 Enterobacter cloacae Z0206为发酵菌，发酵生产生物纳米单质硒； 包括以下步骤： (1) 活化的Enterobacter cloacae接种于发酵培养基中，加入亚硒酸钠溶液； (2) 振荡培养； (3a)收集发酵液，离心后保留上清，将上清再次离心，沉淀以双蒸水重悬后超声处理， 向液体中加入正己烷，混匀后静置分层，生物纳米单质硒存在于下层红色水相中；其中，第 一次离心条件为4°C，5000 X g，15分钟，第二次离心条件为4°C，25000 X g，15分钟，超声处理 条件为25W，5s ON/ 5s 0FF，15分钟，正己烷加入量为液体体积的二分之一;或者（3b)收集 发酵液，离心后保留上清，向上清中加入预冷无水乙醇，即为生物纳米单质硒-多糖复合物； 其中，离心条件为5000Xg，15分钟，无水乙醇加入量为上清液体积的3倍。
[0007] (1)中，发酵培养基成分为蔗糖25g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨5g/l，三水合磷 酸氢二钾2 · 62g/l，磷酸二氢钾lg/Ι，硫酸镁0 · 5g/l;初始pH=7 · 5。
[0008] 所述步骤(1)中，培养基中亚硒酸钠终浓度为10mM。
[0009] 所述步骤(2)中，培养温度为32°C，转速为250rpm，培养时间为144小时。
[0010] -种所述的方法得到的生物纳米单质硒的应用，作为猪饲料的添加剂，用来替代 亚硒酸钠。
[0011]本发明公开了利用E. cloacae Z0206制备生物纳米单质硒及其多糖复合物的方 法，对于制备的各种参数和条件等做了优化，克服了产品潜在的缺陷和生产的不确定性，易 于大规模的应用和生产。
[0012] 本发明制备的生物纳米单质硒或者复合物添加至猪饲料中替代亚硒酸钠，达到促 进生长，改善抗氧化功能和免疫功能的效果。
【附图说明】
[0013] 图1不同浓度亚硒酸钠对E. cloacae Z0206生长的影响； 图2不同浓度亚硒酸钠条件下E. cloacae Z0206发酵液亚硒酸钠残留量变化； 图3不同亚硒酸钠浓度条件下E. cloacae Z0206对亚硒酸钠的平均消耗速率； 图4 E. cloacae Z0206与生物纳米单质硒场发射扫描电镜及能谱分析。分为A-E部分， 其中，A、场发射扫描电镜照片;B、碳元素分布图与硒元素分布图合并;C、碳元素分布图；D、 硒元素分布图;E、能谱分析图； 图5 E. cloacae Z0206与生物纳米单质硒透射电镜与能谱分析。分为A-E部分，其中， A、透射电镜照片，B、颗粒1能谱分析结果;C、颗粒2能谱分析结果;D、颗粒3能谱分析结果;E、 颗粒4能谱分析结果； 图6纯化生物纳米单质硒透射电镜； 图7纯化生物纳米单质硒粒径分析。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1不同浓度亚硒酸钠对E. cloacae Z0206菌株生长及亚硒酸钠还原效率 的影响 1.培养基配制 LB液体培养基:NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，去离子水1L，121°C高温灭菌 20min〇
[0015] LB平板培养基:NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂15g，去离子水1L，121 °〇高温灭菌20min。
[0016]发酵培养基：鹿糖25g，胰蛋白胨5g，酵母提取物5g，K2HP〇4· 3H20 2.62g，KH2P〇4 1区，]\%3〇4〇.58，去离子水11^，初始。!1为7.5，115°(^高温灭菌3〇111；[11。
[0017] 菌种活化 将冻存于-80°C的E. cloacae Z0206菌种常温解冻，取一环在LB平板培养基划线，于32 。(:培养 24h。
[0018]从平板培养基挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于32°C，250rpm培养18h作为种 子液。
[0019]接种与发酵 将活化的E. cloacae Z0206菌液以roS稀释至0D6Q()=0.5,以1%接种量接种至含OmM， 0.511^，111^，511^，1〇11^，1511^亚硒酸钠的发酵培养基中，每个浓度梯度三个重复。于32°(：， 250rpm培养。并在培养的第4h，8h，12h，16h，20h，24h，36h，48h，72h和96h采集菌液样品，检 测菌体蛋白质含量，用于表征细菌数；在培养的第Oh，12h，24h，36h，48h，72h，96h，120h， 144h，168h采集样品，检测亚硒酸钠残留量。
[0020] 结果 亚硒酸钠对E. cloacae Z0206生长的影响如图1所示，无亚硒酸钠的对照组在培养的 第12小时即达到平台期，而添加亚硒酸钠导致E. cloacae Z0206生长速度显著降低，且抑 制作用随着亚硒酸钠浓度的升高而增强。
[0021 ] 不同浓度亚硒酸钠条件下E. cloacae Z0206对亚硒酸钠还原效率如图2和图3所 示，细菌在生长的最初阶段即开始消耗亚硒酸钠，且0.5mM组、ImM组、5mM组和10mM组亚硒酸 钠分别在第48h、48h、72h和144h消耗尽，而15mM组在监测结束时(第168h)亚硒酸钠消耗率 为91.35% ± 1.40%。
[0022] 实施例2以E. cloacae Z0206和亚硒酸钠合成生物纳米单质硒 将活化的E. cloacae Z0206菌液稀释至0D6Q()=0.5，以1%接种量接种至发酵培养基，加 入亚硒酸钠使其终浓度为10mM，于32°C，250rpm条件下培养144小时。
[0023] CN104774875所公开的生物纳米硒制备方法仅说明了制备生物纳米硒的菌种，亚 硒酸钠/硒酸钠浓度梯度和时间梯度设置，并未说明生物纳米硒制备的最优条件。而本发明 根据实施例1中不同亚硒酸钠浓度条件下^.〇1〇&〇&6 20206(0610：^).2279，现有技术） 菌种生长以及亚硒酸钠转化效率差异，筛选得到最优亚硒酸钠添加量和培养时间。
[0024] 而本研究组自主分离的E. cloacae Z0206,源于肉灵芝，胞外多糖产量高，耐硒性 能强。实验证明其分泌的胞外多糖可以显著增强动物抗氧化功能、免疫功能，显著促进动物 生长。以E. cloacae Z0206制备生物纳米单质硒可以得到生物纳米单质硒-多糖复合产物， 可以发挥双重功效，在畜牧生产中具有广阔的应用前景。
[0025]实施例3细菌与生物纳米单质硒的电镜观察及能谱分析 取实施例2中的发酵液lmL离心弃上清，将沉淀以PBS清洗3遍后，加入2.5%戊二醛固定 过夜。以PBS