脂肪酸和衍生物的生产的制作方法
【专利说明】脂肪酸和衍生物的生产 发明领域
[0001] 本发明涉及通过生物技术方式的脂肪酸生产。具体地，本发明涉及从可再生资源 的具有多于5个碳原子的脂肪酸的生物技术生产。
【背景技术】
[0002] 脂肪酸和/或甘油三酯在多种工业中具有各种用途。在食品工业中，例如，脂肪酸 和/或脂肪三酯可以用于动物饲料以及用于补充营养。脂肪酸和/或甘油三酯也可以用于 化妆品和药学领域中。这些应用可需要游离脂肪酸或甘油三酯。这些脂肪酸和/或甘油三 酯的天然资源相当有限。
[0003] 例如，各种多不饱和脂肪酸（PUFA)和含PUFA的甘油三酯主要得自于微生物，例 如被孢霉（ifortiereWa)和裂殖壶菌或产油植物，例如大豆或油菜，藻 类，例如隐甲藻（Ctjt? Mecoi/ifliiMDr)、褐指藻?χ/ω?)等，其中它们通常以其甘 油三酯的形式获得。游离PUFA通常通过水解从甘油三酯制备。然而，长链多不饱和脂肪酸 不能从天然油料作物植物有效地分离。
[0004] 传统上，工业规模生产的脂肪酸和/或甘油三酯起始于石油化学品衍生的材料。 这通常起始于对环境有害的汽油或石油的裂化。此外，由于这些起始材料的价格将与石油 的价格关联，且预期石油价格在未来提高，脂肪酸和/或甘油三酯的价格也会相对于石油 价格的提尚而提尚。
[0005] 因此，期望找到不同于以纯石油为基础的更为可持续的新材料，作为用于脂肪酸 和/或甘油三酯生产的起始材料，其对环境产生的破坏也更少。
[0006] 过去已经描述了朝向脂肪酸生产的一系列生物技术途径。然而，由于产率低、纯度 不足以及需要多步纯化程序，它们都不适合用于从可再生能源商业大规模地生产脂肪酸。 具体地，供给至生物技术上有用的生物体的碳底物实际上只有小部分被转化成所需的产 品，而大部分被初级代谢反应消耗。
[0007] 与生物技术途径相关的另一个问题是获得产品的混合物并且因此组成难以控制 的事实。更具体地，虽然可生产一系列的脂肪酸，但单一加合物的生产会是理想的。由于混 合物包含在化学结构方面高度相关的化合物，以有效且直接的方式纯化或至少富集单一组 分通常超出技术可行性的范围。
[0008] 因此，本领域需要从可再生能源生产脂肪酸的更有效的方式。
【发明内容】
[0009] 根据本发明的任何方面的方法尝试解决上述问题。具体地，根据本发明的任 何方面的方法可以能够使用至少一种遗传修饰的氢氧化细菌（hydrogen oxidising bacteria)，以通过首先将碳源转化成酰基CoA，并且随后将酰基CoA转化成丙二酰CoA，并 且随后最后将丙二酰CoA转化成至少一种具有多于5个碳原子的脂肪酸的方式，将碳源转 化成至少一种脂肪酸和/或其衍生物。根据本发明的任何方面的方法允许在不存在富含能 量的有机化合物的情况下，生产脂肪酸及其衍生物。此外，根据本发明的任何方面的方法提 供朝向脂肪酸及其衍生物的生产的有效生物技术途径。在根据本发明的任何方面的方法 中，所得的脂肪酸及其衍生物中的更多的碳原子源自于二氧化碳分子，即与本领域中已知 的其他方法相比，使用根据本发明的任何方面的方法，源自二氧化碳而不是源自任何其他 有机分子（例如醇类或碳水化合物）的碳原子的比例更高。
[0010] 根据本发明的一个方面，提供了从包含氏、〇)2和/或0 2的气体生产至少一种脂肪 酸和/或其衍生物的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 提供在含水培养基中的遗传修饰的氢氧化细菌；和 (b) 使所述含水培养基接触以20-70 :10-45 :5-35的重量比包含氏、0)2和/或02的气 体； 其中，所述脂肪酸包含至少5个碳原子，并且 其中，所述氢氧化细菌相对于野生型细菌是遗传修饰的，以提高酶表达并提高酶 E2的表达，所述酶E i能够催化乙酰CoA经丙二酰CoA至酰基ACP的转化，所述酶E 2能够催 化酰基ACP至脂肪酸的转化。
[0011] 根据本发明的任何方面的遗传修饰的氢氧化细菌是指可经过工程化以产生各种 脂肪酸及其衍生物的重组氢氧化细菌，所述脂肪酸衍生物包括但不限于短链醇类，例如乙 醇、丙醇、异丙醇和丁醇，脂肪醇、脂肪酯、烃类和蜡酯等。
[0012] 在一个实施例中，本公开提供了修饰氢氧化细菌，从而使其生产并且任选地释放 从可再生碳源生成的脂肪酸和/或其衍生物的方法。此类氢氧化细菌是遗传工程化的，例 如，通过引入编码一种或多种蛋白的外源DNA序列，所述蛋白能够代谢可再生碳源，以生产 并且在一些实例中分泌脂肪酸衍生物。随后，所述经修饰的氢氧化细菌能够用于发酵过程， 以使用可再生碳源（生物质）作为起始材料生产有用的脂肪酸和/或其衍生物。在一些实 例中，因为易于对其途径进行工程化以控制生长、生产以及减少或消除降低生物合成途径 效率的副反应，所以使用现有的在遗传上易控制的氢氧化细菌。此外，此类修饰的氢氧化细 菌可用于消耗可再生碳源以产生燃料，所述燃料能够直接作为生物燃料使用，而无需用于 贮存或运输的专门方法。在其他实例中，对天然产生烃类的微生物进行工程化，以通过表达 提高脂肪酸生产的外源核酸序列而过量产生烃类。
[0013] 根据本发明的任何方面的方法可用于生产具有限定的碳链长度、分支和饱和水平 的脂肪酸和/或其衍生物。在具体实例中，同质产品的生产降低了与发酵和分离相关的整 体成本。具体地，所述脂肪酸包含至少5个碳原子。例如，所述脂肪酸可以是饱和或不饱和 的。所述脂肪酸可包含 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 个碳原子。在一 些实例中，所述脂肪酸包含多于20个碳原子。更具体地，所述脂肪酸和/或其衍生物可包 含长度为至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34个碳的碳链。在一些实例 中，至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的制成的脂肪酸和/或衍生物产品的包含长度 为至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34个碳的碳链。在另外其他的实例 中，至少60%、70%、80%、85%、90%或95%的脂肪酸和/或衍生物产品包含1、2、3、4或5个不 饱和点。具体地，根据本发明的任何方面的方法可导致脂肪酸的组合的生产。更具体地，结 果可包含生产至少2、3、4、5或6种脂肪酸的组合。
[0014] 根据本发明的任何方面，用于步骤（b)中的碳源可以是任何可再生的碳源。具体 地，所述碳源可包含H2、〇)2和/或0 2。更具体地，所述碳源包含氧气，允许在有氧的条件下 生产脂肪酸。
[0015] 氢气在引入步骤（b)中的Η2、〇)2和02气体中的分压可以是0· 1-100巴、0.2-10 巴，特别是0.5-4巴。二氧化碳在引入步骤（b)中的含氏、〇)2和0 2气体中的分压可以是 0. 03-100巴，特别是0. 05-1巴，更特别是0. 05-0. 3巴。氧在引入步骤（b)中的H2、0)2和 〇2气体中的分压可以是〇. 001-100巴，特别是〇. 04-1巴，更特别是0. 04-0. 5巴。具体地， 步骤（b)中的氏和/或C02的来源可以是合成气。所述合成气可以与氧组合使用，成为引 入步骤（b)中的氏、〇) 2和02气体的来源。更具体地，根据本发明的任何方面，引入步骤（b) 中的H2、0) 2和0 2气体可包含合成气。
[0016] 例如，合成气可以从煤气化的副产物提供。因此，氢氧化细菌将作为废产品的物质 转化成有价值的原材料。
[0017] 可选地，可以通过广泛可得的低成本农业原料的气化提供合成气，用于根据本发 明的任何方面的方法。由多种能够转化成合成气的原材料的实例，几乎所有形式的植物都 可以用于此目的。原材料的实例为多年生草例如芒草，玉米残渣，加工废物例如锯末。通常， 主要经过热解、部分氧化和/或蒸汽重整，可以在干燥生物质的气化设备中获得合成气，且 主要产品为例如氏、〇) 2和02。通常对部分的产品气体进行加工以优化产品产率并且避免焦 油的形成。可以使用石灰和/或白云石进行对合成气中不期望的焦油和C0的裂化。这些 方法详细描述于Reed, TB, 1981中。也可使用不同来源的混合物，用于合成气的生成。
[0018] 具体地，步骤（b)中的合成气中含有的碳包含氢氧化细菌在方法步骤（b)中可得 的所有碳源的至少50重量％或至少70重量％、90重量％的碳，其中煤物质的重量百分比涉 及碳原子。除了来自合成气的C0 2之外的其他碳源可以是氢氧化细菌可得的，例如以含水 培养基中碳水化合物的形式。
[0019] 更多的0)2源，例如烟道气、石油炼厂气、酵母发酵或梭菌发酵的产物，来自含纤维 素材料的气化或煤气化的废气等，可作为〇) 2源用于引入步骤（b)的h2、〇)2和02气体中。
[0020] 具体地，引入步骤（b)的气体以分别为20-70 :10-45 :5-35的重量比包含H2、C02 和/或02。氏和0 2的比例可根据来源而改变。例如，Η 2与0 2的重量比可以是2:1、4:1、5:1 等。
[0021] 术语"氢氧化细菌"可以与术语"氢氧混合气细菌（knallgas bacterium)"互 换使用，并且是指能够氧化氢，使用氧作为终末电子受体，并且能够在有氧条件下固定二 氧化碳的任何细菌。具体地，氢氧混合气细菌可以选自甲烷杆菌（ifeiAMoAacieriy?)、 醋杆菌（JceioAacierii/a?)、脱硫弧菌（Zfesi/i/bKiArio)、脱硫单胞菌搬was)、 副球菌、无色杆菌（JcArcwoAacter)、产喊菌、假单胞菌 、诺卡氏菌（Abcart/ia)和贪铜菌（Cy/iria Kiofe)。更具体地，氢氧混合 气细菌可以是贪铜菌菌株，甚至更具体地是钩虫贪铜菌H16 flecaior H16)。示例性的氢氧混合气细菌可包括但不限于：敏捷食酸菌/aciJis)， 食酸菌属种（Jcii/orarax 6·/λ )，真养产碱菌（WcaJi供ei/iTOjOAs)、产碱菌属种 5/7.)、大豆慢生根瘤菌、慢生根瘤菌属 种 6·/?.)、钩虫贪铜菌 DSM 仍￥ 於乃、 螺杆菌属种（ZfeiioAac ier 5/7.)、氢杆菌属种（办ier 5/7.)、嗜热氢杆菌 {Hydrogenobacter thermophilu^)、氧赛篆革觀舊{Hydrogenomonas eutrophd)、泛赛 氢单胞菌（办、氢单胞菌属种（办57?·，）、易 捷氢单胞菌（办、氢胞菌属种（办职）、海洋 氢弧菌（办舰(菌株 MH-110)、氢弧菌属种（办 职）、氢氧微生物（(25〔滅^//^供/? 、氢嗜热假单胞菌（/^^成，/?狀 如办收)、氢假单胞菌rara)、假单胞菌属种 (/^^成敵?/?狀57?·)、真养劳尔氏菌（7? A 仙iropAa)、劳尔氏菌属种（7? A 57?.)、大豆根瘤菌 、根瘤菌属种57?.)、不透明 红球菌<9/哪狀)、红球菌属种职）、嗜酸红假单胞菌 {Rhodopse