一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学技术领域，具体设及一种植物全蛋白提取液的GSTs活性分析 方法。
【背景技术】
[0002] 谷脫甘肤转移酶(GSTs)具有多种催化活性:可W将还原型谷脫甘肤(GSH)共价偶 联到含有亲电子碳、氮、硫原子的非极性化合物上，从而使GSTs做为中屯、元件参与到药物、 农药及其它异源物质的代谢去毒过程;GSTs还可W催化还原一些氧化胁迫的代谢产物，如 过氧化物等，从而使得GSTs在防御病菌侵染和非生物胁迫中发挥重要的作用。因此，在很多 植物研究中都将GSTs活性作为一个重要指标来评价植株的生长状态和胁迫反应特性。
[0003] GSTs活性的分析方法WCDNB偶联活性的分析为主，目前文献上的一些方法在CDNB 和G甜使用量上的差异较大，且CDNB多是溶于乙醇或乙醇/水溶液中。事实上CDNB在乙醇中 的溶解度较低，更难溶于乙醇/水溶液中，因此有些文献中CDNB的使用量实际上是较难达到 的，且乙醇加多会引起蛋白变性；另外高CDNB和G細含量时本底反应较高，会掩盖酶催化反 应;还有一些方法需要对全蛋白提取液进行进一步的操作W提高GSTs的蛋白含量。运些方 法在实验中的实际操作性较低。本发明在现有分析方法的基础上，通过反复实验，确定了一 个适用于植物全蛋白提取液的CDNB偶联活性分析方法。
【发明内容】
[0004] 本发明提供的一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，该方法通过反 复实验，选择适用于植物全蛋白提取液的CDNB偶联活性分析方法实现的。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0006] -种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，W烟草叶片或根的全蛋白提 取液为样品，同时W提取液为对照样，WG甜和CDNB为反应底物，通过测定GS-CDNB偶联产物 的量分析GSTs的活性。
[0007] 所述全蛋白提取液为非变性提取液。
[000引所述GSTs活性分析方法的反应体系，按顺序在一个比色皿中依次加入50~20化1 提取的全蛋白、1~化1 G甜和0.1~0.化1 CDNB，并加入缓冲液至100~40化1。
[0009] 所述CDNB用丙酬溶解，浓度为0.1-1.5M。
[0010] 所述反应体系中G甜与CDNB的摩尔浓度比大于2。
[0011] 所述G甜用全蛋提取液溶解，浓度为40mM-200mM。
[0012] 所述植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，作为筛选高GSTs活性优良植株、除 草剂的应用。
[0013] 本发明的有益效果：改进后的方法将CDNB的溶剂由乙醇改为丙酬，大大提高了 CDNB的溶解性，在同样CDNB浓度下降低了溶剂的使用量，从而避免了由过量溶剂引起的蛋 白变性；同时，改进后的方法增加了谷脫甘肤(GSH)与CDNB的摩尔比，使其更有利于分析 GSTs蛋白含量较低的植物全蛋白提取液。
【附图说明】
[0014] 图1为烟草幼苗根和叶片的GSTs活性；
[0015] 图2为不同品种玉米叶片的GSTs活性；
[0016] 图3为不同品种玉米根的GSTs活性； 图4为不同农药对烟草根中GSTs活性的影响； 图5为不同农药对烟草叶片中GSTs活性的影响。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，运些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。
[001引实施例1
[0019] 比较烟草根和叶片GSTs活性分析方法的应用
[0020] 试剂的配制：称取0.20255克CDNB(分子量为202.55)溶于Iml丙酬，配成IM CDNB溶 液，冻存于-20°C;称取0.61466克还原型谷脫甘肤(G細，分子量为307.33)溶于IOml提取液 中，配成200mM G甜溶液，每份Iml冻存于-20°C，用前取出一份于冰上融化。
[0021] 材料的准备：W生长至6叶龄的烟草叶片和根为材料，采集完全展开的第=、四位 叶片，称重后使用；用清水洗净根部的±壤，滤纸吸干水分，称重待用。
[0022] 全蛋白提取液(粗提液）的制备：使用pH为7.5的憐酸缓冲液（不含尿素）按照1:3 (w/v)的比例加入烟草叶片或根中，冰浴研磨至匀浆，14000Xg、4°C离屯、15min，上清即为烟 草叶片或根的全蛋白粗提液，冰浴放置。
[0023] 酶活性检测：预热酶标仪（型号为MD SPECTRA max plus384)，设定测试溫度为37 °C，设定波长为340nm，测定时间为5min，间隔15秒读数一次，第一次读数前振荡混匀5秒，每 个样品设S个重复，在96孔酶标板(Nunc 475094)上按照空白对照、叶片全蛋白粗提液、根 全蛋白粗提液的顺序依次加入10化1的样品，按照10个反应的量，配置反应液:在IOml离屯、 管中依次加入97祉1憐酸缓冲液、融化的G甜溶液、化1 CDNB溶液，马上摇动混匀，每个 样品中加入10化1反应液，放入酶标仪进行测试。
[0024] 结果分析:本次实验所使用的G細与CDNB的摩尔比为4.8:1，运是由于蛋白粗提液 中的成分复杂，可与G細作用的蛋白较多，因此高的GSH/CDNB摩尔比可W保证有足够的GSH 与GSTs结合用于CDNB的偶联反应。本次实验的酶标仪测试结果见表1，可见每个样品S次 重复的一致性较好;反应伊始加入蛋白粗提液的光吸收值显著高于对照，说明粗提液的基 质效应较高，因此蛋白粗提液的加入量不应太高，尤其是使用比色杯进行测定时，否则会导 致光吸收值超出仪器的量程；
[00巧]表1. CDNB偶联分析中各反应池在340nm处的光吸收值
[0027]注:-1、-2、-3为同一样品的实验重复序号
[002引连续监测340nm下5min内的光吸收变化值，使用1~5min内的数值，计算A A340/ min0
[0029] 根据测试结果使用开始(Omin)和2min时的光吸收值计算AA340/min，将每个样品 =次重复的数据进行平均得到：
[0030] A A340/min(根）=0.01045;
[0031] AA340/min(叶）=0.0076;
[0032] A A340/min(对照）=0.0065;
[0033] 按照活性计算公式，计算根和叶片全蛋白提取液的GSTs活性，结果如图1所示，烟 草根中的GSTs活性要明显大于叶片中的GSTs活性。
[0034] 活性计算步骤如下:活性(皿ol/min/ml ?粗提液）=[AA340/min(样品)-A A340/ min(空白对照）]X化ea(ml )A (mM-lcm-l )/Venz(ml) X 1000;其中，Vrea为反应总体积， Venz为加入的粗提液体积，e为消光系数（1cm光径比色杯的消光系数为9.6,96孔板2(K)山反 应体系的消光系数为5.3)。
[0035] 活性单位为每ml全蛋白粗提液每分钟催化产生的GS-CDNB偶联产物的曲1〇1数。
[0036] 实施例2
[0037] GSTs活性分析方法在筛选高GSTs优良植株中的应用
[0038] 分别W东农248、东农9702、东农晚粘、东甜3号玉米品种的叶片和根为样品，同时 W提取液为对照样，WG甜和CDNB为反应底物，测定GS-CDNB偶联产物的量分析GSTs的活性。 具体步骤如下：
[0039] 试剂配制参考实施例1。
[0040] 材料的准备:将几种玉米种子播于水培育苗盘中，待长至3叶龄时，收集全部叶片 称重备用;将根部剪下在清水中冲洗3遍，用滤纸吸干后称重。
[0041] 全蛋白粗提液的制备参考实施例1。
[0042] 酶活性检测和活性计算参考实施例1。
[0043] 实验结果:不同玉米样品叶片和根的全蛋白提取液中CDNB偶联活性的变化如图2 和图3所示，各品种的叶片和根中的GSTs活性差别不大，各品种间的GSTs活性差别明显，排 序为：东农248>东农9702>东农晚粘> 东甜3号。所述植物全蛋白提取液的GSTs活性分析 方法可用于筛选高GSTs活性的品种。
[0044] 实施例3
[0045] GSTs活性分析方法在筛选除草剂中的应用
[0046] 分别W不同待筛选烟用除草剂喷施烟草，取叶片和根作为样品，同时W未施除草 剂的烟草叶片和根为对照样，WG細和CDNB为反应底物，测定GS-CDNB偶联产物的量分析 GSTs的活性。具体步骤如下：
[0047] 试剂配制参考实施例1。
[004引材料准备：
[0049] 酶活性检测和活性计算参考实施例1。
[0050] 从市场购置烟草农业上常用除草剂敌草胺、百草枯；当实验室内±培栽培烟草 (Nicotianatobacum L.)生长至6叶龄时，按照施用说明建议的用量分别喷施在种植烟草的 ±壤表面或烟草叶片上，分别在施用农药前、施用后5小时、1天、2天取烟草幼苗的根和第 S、四位叶片，同时取未施用农药的烟草对照样品。
[0051 ]全蛋白粗提液的制备参考实施例1。
[0052] 酶活性检测和活性计算参考实施例1。
[0053] 结果分析:不同除草剂处理后烟草根和叶片全蛋白提取液中CDNB偶联活性的变化 如图1和图2所示，敌草胺可显著提高烟草根或叶片中的GSTs的活性，说明敌草胺对烟草 GSTs的表达具有诱导作用。高GSTs活性有利于异源物质的代谢去毒，因此根据GSTs在异源 有毒物质代谢中的作用，在本实验所筛选的两种农药中，除草剂敌草胺可优先应用于烟草 农业实际生产。
【主权项】
1. 一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，以植物叶片和根的全蛋白提取 液为样品，同时以提取液为对照样，其特征在于：以G S Η和C D N B为反应底物，通过测定G S -⑶ΝΒ偶联产物的量分析GSTs的活性。2. 如权利要求1所述的适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，其特征在于:所 述全蛋白提取液为非变性提取液。3. 如权利要求1所述的适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，其特征在于:所 述GSTs活性分析方法的反应体系，按顺序在一个比色皿中依次加入50~200μ1提取的全蛋 白、1~4ylGSH和0 · 1~0 · 4ylCDNB，并加入缓冲液至100~400μ1。4. 如权利要求1或3所述的适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，其特征在 于:所述⑶NB用丙酮溶解，丙酮浓度为1M。5. 如权利要求1所述的适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，其特征在于:所 述反应体系中GSH与CDNB的物质的量浓度比大于2。6. 如权利要求1所述的适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，其特征在于:所 述GSH用浓度为40mM-200mM的全蛋提取液溶解。7. -种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，作为筛选高GSTs优良植株、除 草剂的应用。
【专利摘要】本发明公开一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，以植物叶片和根的全蛋白提取液为样品，同时以提取液为对照样，以GSH和CDNB为反应底物，通过测定GS-CDNB偶联产物的量分析GSTs的活性。改进后的方法将CDNB的溶剂由乙醇改为丙酮，大大提高了CDNB的溶解性，在同样CDNB浓度下降低了溶剂的使用量，从而避免了由过量溶剂引起的蛋白变性；同时，改进后的方法增加了谷胱甘肽（GSH）与CDNB的摩尔比，使其更有利于分析GSTs蛋白含量较低的植物全蛋白提取液。
【IPC分类】C12Q1/48
【公开号】CN105603047
【申请号】CN201511026270
【发明人】周会娜, 陈霞, 翟妞, 刘萍萍, 陈千思, 郑庆霞, 张慧, 徐国云, 林福呈
【申请人】中国烟草总公司郑州烟草研究院
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年12月31日