一种h7n9亚型禽流感病毒检测试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种分型检测H7N9亚型禽流感病毒核酸的 RT-PCR-ELISA试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 甲型流感病毒分类上属于正粘病毒科，基因组由8个单链负义RNA节段组成。甲型 流感病毒宿主较广，可W感染人、禽和其它哺乳动物。根据病毒表面2个糖蛋白血凝素化A) 和神经氨酸酶(NA)的抗原性，甲型流感病毒可W分为不同的血清亚型。目前已在甲型流感 病毒的自然储存宿主野生水禽中发现16种HA亚型化1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)。一般情况 下，禽流感病毒不会突破种属障碍感染人。但自1997年香港H5N1禽流感病毒感染人事件W 来，禽流感病毒(包括H5、朋和H7亚型)感染人事件的发生越来越频繁。2013年初，在我国长 S角地区出现一种新的通过基因重配产生的H7N9亚型禽流感病毒，该病毒能够跨物种感染 人并引起严重疾病。目前中国大陆的省份和地区都有病例报道，截止，对人类健康和公共卫 生造成新的重大威胁。
[0003] 目前针对H7N9亚型禽流感病毒感染的核酸检测方法主要有基因测序法、Realtime t ime PCR 法和环等溫扩增化 AMP) 法等 。基因 测序法是分子诊断的 金标准 ，但耗时费 力，一般需要24-48小时，对实验人员的技术要求高，同时试验仪器和试剂昂贵，一般实验室 难W开展。Real-time time PCR法和LAMP法具有很好的特异性和敏感性，但前者同样依赖 昂贵的仪器和试剂;而后者难W实现多重检测。因此，建立一种成本低、通量高、适合现场诊 断的H7N9亚型核酸分子检测方法，对于疾病的临床救治和防控意义重大。
【发明内容】
[0004] 本发明需要解决的问题是提供一种分型检测H7N9亚型禽流感病毒核酸的多重 PCR-ELISA试剂盒及其使用方法。
[0005] 本发明提供的检测H7N9亚型禽流感病毒核酸的多重PCR-ELISA的试剂盒由RT-PCR 反应体系；3个祀基因甲型流感病毒M基因、H7N9亚型病毒HA基因和H7N9亚型病毒N9基因的 阳性质粒:pMD-M、^d-HT和化d-N9;阴性质控品和3个祀基因的特异性引物探针(表1)组成， 探针的5端用生物素 (BI CtO)标记。
[0006] 表1祀基因的特异性引物探针
[000引本发明所述一种多重PCR-ELISA试剂盒在H7N9亚型禽流感病毒分型检测中的使用 方法：
[0009] (1)病毒核酸提取:采用常规方法提取临床鼻咽拭子标本或病毒培养物核酸，-70 °(：冰箱放置备用。
[0010] (2)多重PRT-PCR反应:采用化KaRa公司的一步法试剂盒进行PCR扩增反应，反应体 系为：10XExTaqBuffer化L，25mMMgCl?^L，2.5mMdNTPs化L，l'aqDNA聚合酶抓，M、H7 和N9上下游引物各0.7扣L，模板1.化L，加 DEPC水至50化.。扩增程序为：50°C逆转录30min， 94预变性2min，热循环参数为94°C变性30s，56 °C退火30s，72°C延伸90s，35个循环后，72°C 延伸7min，得到生物素标记的PCR产物，同时设置空白对照组。
[0011] (3化LISA检测：取扩增好的生物素标记的PCR产物扣L，加至10化的O.lmol/L NaOH 溶液中，于室溫下变性lOmin，再加入lOnmol/L地高辛标记的特异性探针(用含有300mmol/L 化Cl，100mmol/L IYis-HCl P册.5，10mmol/L 邸TA，0.1%Twee-20的杂交液稀释），50°C解 育lOmin。随后，取100化液体加至链霉亲和素包被的96孔微板中，50°C解育60min，弃去孔中 液体，加入30化L PBST洗板5次。然后加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体10化L，37°C 解育60min，洗板5次，最后加入TMB显色液进行显色，一定时间后加入终止液终止显色，于酶 标仪450nm波长处测定其吸光度值(OD)。本实验需设置两个或两个W上重复，同时WPCR扩 增反应中的空白对照作为阴性对照组，若实验组的OD值〉2倍阴性对照组平均OD值，则判定 为阳性，反之则为阴性。
[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：。
[0013] 设计针对H7N9流感病毒3个祀基因的特异性引物探针，通过PCR-化ISA方法，可W 对临床、环境及动物标本和病毒分离物进行H7N9亚型流感病毒分型鉴定，具有快速、敏感、 特异等特点;且无需昂贵仪器设备，便于操作，为H7N9亚型流感监测和临床救治提供一种新 的检测方法，是一种成本低、通量高、适合现场诊断的H7N9亚型核酸分子检测方法。
【附图说明】
[0014] 图1通过M、H7、N9质粒比较普通PCR和PCR-ELISA的敏感性
【具体实施方式】
[0015] 下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于 实施例。
[0016] 实施例1:祀基因质粒构建
[0017] 设计特异性引物，分别针对甲型流感病毒M基因、H7亚型病毒HA基因和N9亚型病毒 NA基因，通过RT-PCR法扩增获得3个目的基因片段，回收纯化后的分别与T载体连接，获得祀 基因阳性质粒，分别命名为pMD-M、^d-HT和化d-N9。
[001引实施例2: PCR-ELISA法敏感性
[0019] (I)PCR反应:分别将祀基因克隆质粒pMD-MJmd-H7和Pmd-N9稀释100倍，再按10倍 梯度稀释成1〇-2-1〇-9共八个浓度，W此为模板，使用上述由生物素标记的引物，采用化KaRa 公司的一步法试剂盒进行PCR扩增反应。反应条件为:94°C预变性5min，热循环参数是94°C 变性30s，56 °C退火30s，72°C延伸90s，35个循环后，72 °C延伸7min，得到地高辛标记的PCR产 物，同时设置空白对照组。将所得到的地高辛标记的PCR产物分别通过ELISA、1.5%琼脂糖 凝胶电泳两种方法来确定各自的敏感性。
[0020] (2化LISA检测：取扩增好的生物素标记的PCR产物扣L，加至10化的O.lmol/L NaOH 溶液中，于室溫下变性lOmin，再加入lOnmol/L地高辛标记的特异性探针(用含有300mmol/L 化Cl，100mmol/L IYis-HCl P册.5，10mmol/L 邸TA，0.1%Twee-20的杂交液稀释），50°C解 育lOmin。随后，取100化液体加至链霉亲和素包被的96孔微板中，50°C解育60min，弃去孔中 液体，加入30化L PBST洗板5次。然后加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体10化L，37°C 解育60min，洗板5次，最后加入TMB显色液进行显色，3min后加入终止液终止显色，于酶标仪 450nm波长处测定其吸光度值(OD)。本实验需设置两个或两个W上重复，同时WPCR扩增反 应中的空白对照作为阴性对照组，若实验组的OD值〉2倍阴性对照组平均OD值，则判定为阳 性，反之则为阴性。