一种控制高粱芒有无基因SbAn-1以及SNP突变位点和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体设及保护控制高梁有芒无芒基因 SbAn-I和该基 因的应用，属于分子生物学和高梁育种领域。
【背景技术】
[0002] 高梁(Sor曲Um bicoloHL. )Moench)属于单子叶植物纲禾本科高梁属，是一年生 高大草本植物，表皮覆盖蜡质，具典型的C4植物特化光合作用器官、高光合效率功能和高产 潜力，具有耐旱、耐溃、耐贫瘡、耐盐碱，种植面积在世界粮食作物中占第5位(前4位依次为 玉米、小麦、水稻、大麦），主要分布在非洲、亚洲、美洲的干旱和半干旱地区，是世界上最古 老的栽培作物之一。高梁的主要产物巧粒除用作食品和饲料外，还可W制酒、制淀粉、制醋、 制始糖等。因为穗的各项表型特征都有可能影响到高梁巧粒的产量，所W与穗型相关的研 究在高梁各项研究中占很大比例。芒是高梁上的性状之一，并且高梁芒位于小花内釋顶端 中肋延伸而成，位于巧粒最顶部，接受充足的光能和C〇2,并且防止鸟类的侵害，可间接提高 巧粒的收获量。
[0003] 全基因组关联分析(6611〇1116-'\￥1(1643 3〇(31曰1:;[0]151：11(17,6胖45)是一种对全基因组范 围内的常见遗传变异(单核巧酸多态性和拷贝数)总体关联分析的方法，它能够在全基因组 范围内进行整体研究，能够一次性对疾病进行轮廓性概览，适用于复杂疾病的研究。在全基 因组层面上，开展大样本、反复验证的基因与疾病的关联研究，可W全面掲示疾病发生、发 展与治疗相关的遗传基础。与图位克隆法(map-basedcloning)相比，全基因组关联分析具 有W下几个方面优点：DGWAS研究不再需要在研究之前构建任何假设;2)可用自然群体，无 需一定是遗传群体，大大缩短了研究年限;3)能够一次性通过监测成千上万个SNPs，对全基 因组范围内整体研究；4) G W A S研究的精度大大提高，例如由玉米的作图精度10 - 3 0 C M (Salvi ,2005)提高到GWAS的精度1500bp(Remington，2001)。随着基因组测序技术的提高及 测序成本的降低，并结合生物信息学的高度发展，GWAS成为挖掘和剖析高梁有无芒基因及 其相关遗传机制最有效的方法之一。
[0004] 芒是禾本科植物主要性状之一，基因组内发生何种变化导致芒的有无及长短等的 变化呢？早在1898年，就有人对禾谷类作物的芒进行过研究，发现其具有气孔且可W固定 C〇2,相继禾谷类作物中大麦和水稻的芒基因研究则较多。2011年，化等精细定位水稻芒相 关基因 Awn4.巧Ij第4号染色体一个330kb的区间范围内；2013年，Luo等克隆到基因 SbAn-I, 并证实该基因不仅控制水稻芒的有无，还影响水稻巧粒的数量和形状。2015年孙传清教授 课题组发现，控制野生稻长、刺芒的基因 LABAUL0NG AND BARB邸AWN 1)，位于水稻第4染 色体长臂上，编码一个细胞分裂素激活酶。该基因在芒原基的特异表达提高了芒原基活性 细胞分裂素含量，增强了芒原基细胞分裂活性，最终引起芒的伸长和芒刺形成。高梁芒基因 的精细定位国内外均鲜见报道，在2014年奮国伟等精细定位在第3条染色体115肺范围内， 但没有克隆到基因。
【发明内容】
[0005] 为解决上述现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种控制高梁芒的有无 基因訊An-I功能。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述控制高梁有芒或无芒的訊An-I基因的检测方法。
[0007] 本发明的再一目的在于提供上述控制高梁芒的有无基因訊An-I的应用。
[0008] 本发明目的是通过如下技术方案来实现的：
[0009] 本发明公开了一种控制高梁芒的有无基因 SbAn-I，WBTx623参考基因组来看，当 无芒时为Sobic.003G417700该基因正常序列，而有芒高梁该基因发生S个位点的突变，第 一个点72367561，T突变为C即TTT(苯丙氨酸）突变为TTC(苯丙氨酸）为同义突变，另外两个 位点发生了非同义突变。非同义突变SNP位点位于高梁基因组3号染色体第72367415位核巧 酸和72367368位核巧酸，该两个位点核巧酸分别由G突变为A，C突变为T，氨基酸分别都由精 氨酸（Arg/R)突变为组氨酸（His/H)和半脫氨酸（Cys/C)，由引物对Sb03g045130F和 Sb03g045130R从高梁基因组DNA中扩增出来的核巧酸序列，经电泳检测测序后，与区分高梁 芒的有无。
[0010] 所述引物对的核巧酸序列如下所示：
[00川上游引物；
[001引下游引物：
[0013] 所述的控制高梁芒的有无基因訊An-I鉴定方法，包含W下步骤：
[0014] (1)通过常规PCR法扩增，获得高梁有芒无芒基因訊An-I基因序列； (2) 利用多序列比对软件工具(如MegAl i gn或DNAMAN软件），将步骤(1)所获得的序列翻 译成蛋白质序列后进行比对，得到高梁有芒无芒基因 SbAn-I所特异的3处单碱基差异，该差 异位于该基因的外显子，最终导致功能特异性氨基酸的改变； (3) 对步骤(2)所获得的序列在不同的高梁自然群体中进行验证，从而确定高梁芒的有 无基因 SbAn-I的功能。经测定有芒样品236份和无芒高梁样品182份，有芒和无芒的基因序 列=个位点发生突变从而区分高梁种质的有芒或无芒，该基因的功能正确率达72% W上。 为了进一步证实该基因 SbAn-I为控制芒的有无基因，利用有芒L361和无芒BTx623的Fi表型 为无芒，杂交后代F2代高梁株系，867株F2单株中，无芒为654株，有芒213株，卡方检验表明， F2群体中无芒与有芒单株数量符合3:1分离模型。从Fi单株表型和F2群体的表型分离情况可 W判定，本研究中双亲芒性受一核质单基因控制，且无芒对有芒为显性。该訊An-I基因在运 些F2群体中所有654株的该基因 S个突变位点SNP为杂合(TC, AG, CT)或未突变(T，G，C)，213 株有芒样品全部为纯合的（C，A，T)。因此，我们确定该基因 SbAn-I即为控制芒的有无的功 能。
[001引进一步的，所述訊An-I的PCR扩增反应体系如下：
[0016] 高梁基因组DNA Iul,上下游引物各Iul JXhq PCR Master Mix 12.5ul，d地2〇 9.5ul 总体积 25ul;
[0017] 反应在BIO-RAD TlOO? lliermal巧cler PCR仪进行扩增，反应流程如下：94°C预 变性3分种;94 °C 30秒、55 °C 30秒、72 °C 50秒，34个循环;72 °C 5分种;4 °C保存。
[0018] 所述高梁芒的有无基因 SbAn-I的应用，包括对高梁种质资源的筛选和鉴定，W及 作为分子标记辅助育种。
[0019] 相对于现有技术，本发明的有益效果为:本发明的控制高梁有无基因 SbAn-I是通 过全基因组关联分析所获得，该技术能够一次性检测到多个核巧酸多态位点，从而有利于 大批量地挖掘与简单性状的基因。选择基因 WPCR技术为基础，可W直接用于高梁芒的有无 基因訊An-I及其等位基因的鉴别，从而实现分子标记辅助育种。
【附图说明】
[0020] 图1为全基因组关联分析CMLM方法获得高梁芒的有无基因定位的Mahattan图；
[0021] 图2为全基因组关联分析获得不同分析方法获得的QQ-Plot图；
[0022] 图3为具有该基因功能特异性SNP的高梁芒有无基因訊An-I的CDS序列比对图；
[0023] 图4为无芒BTx623与有芒L361高梁基因组訊An-I氨基酸比对图。
[0024] 图5为具有该基因功能特异性SNP的高梁芒有无基因訊An-I的氨基酸比对图；
[0025] 图6为高梁芒基因訊An-I分离群体中的测序图。 实施例1 控制高梁芒的有无基因 SbAn-lWBTx623参考基因组来看，当无芒时为 Sobic.003G417700该基因正常序列，而有芒高梁该基因发生S个位点的突变，第一个点 72367561，T突变为C即TTT(苯丙氨酸）突变为TTC(苯丙氨酸)为同义突变，另外两个位点发 生了非同义突变。非同义突变SNP位点位于高梁基因组3号染色体第72367415位核巧酸和 72367368位核巧酸，该两个位点核巧酸分别由G突变为A，C突变为T，氨基酸分别都由精氨酸 (Arg/R)突变为组氨酸（His/H)和半脫氨酸（Cys/C)，由引物对Sb03g045130F和 Sb03g045130R从高梁基因组DNA中扩增