肉鸭otxr基因单核苷酸多态性及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子遗传学领域，设及W肉鸭的功能基因的单核巧酸多态性(SNP)作 为分子遗传标记，特别设及肉鸭OTXR基因的单核巧酸多态性及其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 单核巧酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核巧酸(A/T/C/G)的替换 而引起的多态性。因此，通常所说的SNP包括碱基的替换、插入、缺失W及重复序列拷贝数的 变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核巧酸的变化，主要由单个碱基的转换或者 颠换所引起;具有转换型变异的SNP约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核巧酸的 胞喀晚是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形 成胸腺喀晚。
[0003] 在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNP，根据它们在基因 组中分布的位置可分为基因编码区SNP (CSNP )、基因周边SNP (pSNP)和基因间SNP (i SNP)等 S类。总的说来，CSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5,但它在遗传病 和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，CSNP又可分为两 种：一种是同义cSNP，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序 列，突变碱基与未突变碱基的"含义"相同；另一种是非同义cSNP，即碱基序列的改变将导致 编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对 编码区SNP的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响。不仅如此，在群体 遗传研究中，运些SNP作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。
[0004] 由于SNP是二等位基因分子标记，所W，理论上在一个二倍体生物群体中，SNP可能 是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNP很罕见，故SNP通常被 简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNP:即DNA序列测 定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核巧酸连接反应等。在运 些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵， 且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所 W，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与 DNA测序结合法检测SNP可W适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比 较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所W，也并非理想的SNP检测手段;AS-PCR方法作为 一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设 计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目 前不具有普遍应用的特点;而引物延伸法和寡核巧酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板 读数仪、基因忍片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施 性不强。
[000引PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进 行切割，然后进行琼脂糖或聚丙締凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法 不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了其费用昂贵、操作繁琐、假阳性率高的缺点，而且所 检测的序列位点无特殊性要求。
[0006] OXTRWwtocin receptor)是一种由389个氨基酸组成的G蛋白偶联受体，由7个跨 膜区域组成，通过与G蛋白偶联，诱发细胞内外巧离子和甘油二醋浓度的变化，影响神经元 细胞的兴奋性及其他生物学效应。已有的研究表明OXTR与能量代谢(食物摄入和能量消耗） 相关。Takayanagi等发现催产素受体缺失的雄性小鼠（0XTR-/-)表现出迟发性肥胖Qate-onset obesity),比如腹部脂肪增加和空腹甘油S醋的增加都比较慢。OXTR-/-小鼠与野生 型小鼠相比，每日食物摄入量和自发性运动没有显著差别。相反，OXTR-/-小鼠的栋色脂肪 组织中含有大量的脂滴，导致产热受损。运项研究表明，OXTR在调节能量平衡中起着重要作 用。因此，研究家禽OTXR基因遗传变异和分子遗传特征具有重要理论和实践意义。
[0007] 国内外关于OTXR基因遗传变异的研究多见于人、鼠等动物，而未见肉鸭OTXR基因 遗传变异或SNP研究的报道。由于目前肉鸭OTXR基因遗传变异领域的研究匿乏，使该基因位 点的功能研究及该基因遗传变异与经济性状关联的研究成为空白。
【发明内容】
[0008] 本发明解决的问题在于提供肉鸭OTXR基因单核巧酸多态性检测方法及其应用，寻 找与肉鸭经济性状相关的SNP作为分子标记，加快肉鸭良种繁育速度。
[0009] 本发明的目的在于提供肉鸭OTXR基因的单核巧酸多态性，该基因单核巧酸多态性 包括：肉鸭OTXR基因外显子2第946位为T或C的单核巧酸多态性。
[0010] 本发明的另一目的在于提供肉鸭OTXR基因的单核巧酸多态性的检巧巧法，W包含 OTXR基因的待测肉鸭全基因组DNA为模板，W引物对P为引物，PCR扩增肉鸭OTXR基因；用限 审雌内切酶PstI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳;根据 电泳结果鉴定肉鸭OTXR基因外显子2第946位的单核巧酸多态性；
[001。 所述的引物对P为：
[0012] 上游引物Pl :5' -GCTTCACGCAGCCTGCAG-3'
[0013] 下游引物口2:5'-166押(：口'60：01；67^-3'。
[0014] 所述的PCR扩增反应程序为：
[001 引 94°(：预变性5111111;94°(：变性303,54.6°(：退火303,72°(：延伸303,35个循环；72°(：延 伸lOmin。
[0016] 所述的琼脂糖凝胶为质量浓度为2.5%的琼脂糖。
[0017] 所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果，OTXR基因外显子2第946位的碱基多态性为:TT 型为1个片段：179bp; CC型为2个片段：17bp和19化P; CT型为3个片段：17bp、179bp和196bp。 由于片段17bp太小，在琼脂糖凝胶不能观察到，所W在琼脂糖凝胶上，TT基因型可W观察到 1条带（179bp);CC基因型可W观察到1条带（196bp)，CT基因型可W观察到2条带（179bp和 19 化 P)。
[0018] 本发明的又一个目的在于提供肉鸭OTXR基因的单核巧酸多态性的检测方法在优 化肉鸭个体育种繁殖中的应用。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有W下有益的技术效果：
[0020] 本发明公开了与肉鸭生长发育相关的功能基因 OTXR的核巧酸多态性，该核巧酸多 态性能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计 肉鸭个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。
[0021 ] 本发明对肉鸭OTXR基因的SNP进行了基因分型和基因频率分析，结果显示OTXR基 因的核巧酸多态位点能够成为分子遗传辅助育种的标记。
[0022] 本发明提供的检测方法为肉鸭OTXR基因的SNP与经济性状关系的建立奠定了基 础，W便用于肉鸭标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的肉鸭种群。
【附图说明】
[0023] 图1为肉鸭OT邸基因外显子2的19化P克隆测序PCR产物电泳图；
[0024] 图2为肉鸭OTXR基因外显子2的196bp PCR产物的PstI酶切电泳检测OTXR基因多态 性的电泳结果图；泳道1: CT基因型个体（179bp和196bp);泳道2: TT基因型个体（179bp);泳 道3、4:CC基因型个体（196bp);M:Marker(2000bp);由于片段17bp太小，在琼脂糖凝胶不能 观察到，所W在琼脂糖凝胶上，TT基因型可W观察到1条带（179bp);CC基因型可W观察到1 条带（196bp)，CT基因型可W观察到2条带（179bp和19化P)。
[0025] 图3为肉鸭OTXR基因 SNP的不同基因型测序峰图，其中图3中由上至下S张图分别 代表CT、IT和CC基因型。
【具体实施方式】
[0026] 本发明WOTXR基因保守序列设计引物扩增OTXR基因外显子2的的196bp片段，W北 京鸭的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，经测序后寻找该扩增片段的单 核巧酸多态;针对发现的单核巧酸多态进行性状关联性分析，并提供其检测方法，使得OTXR 基因的核巧酸多态性成为一种能够快速、方便检测的分子遗传标记，为加快建立具有优质 经济性状的肉鸭种群提供依据。
[0027] a、肉鸭OT邸基因部分DNA序列的克隆及其多态性的检测 [002引1、肉鸭血样的采集及处理
[0029] 取北京鸭血样6mL，加入0.5mol/L的抗凝剂ACD ImL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰 盒，-80°C保存备用。
[0030] 本发明采用北京鸭样品，来源于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，共随机采 样188只。
[0031 ] 2、血样基因组DNA的提取、纯化
[003引 （1)取20化抗凝全血置于1. SmL的离屯、管中，再添加500化1 X STE缓冲液、1扣 L20 % SDS和20化0.01 mg/化蛋白酶K，置于55 °C水浴锅中，过夜消化。
[0033] (2)将离屯、管取出，添加500化饱和酪，于冰盒中轻摇20min，离屯、IOmin(1000 Or/ min) O
[0034] (3)取上清，放到新的离屯、管中（无菌），加入50化L饱和酪，于冰盒中轻摇20min，离 屯、IOmin(lOOOOr/min)。
[0035] (4)取上清，移入新的灭过菌的离屯、管中，加入50化L氯仿-异戊醇(氯仿-异戊醇体 积比24:1)，于冰盒中轻摇2〇111；[]1，离屯、1〇111；[]1(1000〇1'/111；[]1)。
[0036] (5)取上清，移到无菌的新的离屯、管中，加入ImL冰无水乙醇（-20°C)，来回颠倒沉 淀物(0臟），离屯、10111111(10000以111111)，轻轻倒掉上清液。
[0037] (6)加入ImL 70%乙醇，清洗DM,lOOOOr/min离屯、5min，弃上清液。
[003引（7)重复步骤6。
[0039] (8)置于通风楓中，干燥2~地，使其水分挥发。
[0040] (9 )DNA完全干燥后，加入200化灭菌后的TE溶液，在4°C冰箱中放置3天，W溶解 DNA。
[0041] (10)将提取到的DNA短期(-20°c)或长期(-70°c)保存，使用前取出稀释即可。
[0042] 3、DNA池的构建
[0043] (1) 1 %琼脂糖凝胶电泳检测
[0044] 选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解 的样品进行DNA池的构建。
[004引（2)0D值测定
[0046] 用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和0D260/ 0D280的比值。如0D260/0D280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酪，则应进行 纯化;若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。
[0047] DNA浓度(yg/mU =50 X0D26日值X稀释倍数 [004引 （3)肉鸭DNA池的构建
[0049] DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至SOmgAiL,然后从50个