检测f8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于体外基因检测领域，尤其设及一种检测F8基因突变的扩增引物、试剂 盒及方法
【背景技术】
[0002] 血友病化emo地ilia)是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，患者由于凝血因 子基因突变而导致凝血因子浓度下降或缺乏，从而造成凝血时间延长、轻微创伤后有出血 倾向性。根据缺乏凝血因子的不同，临床上分为血友病A(hemophiIia A，HA)和血友病B 化emopMlia B，皿）。其临床表现主要为自发性、轻微外伤后出血难止或创伤、手术后严重 出血等。出血的部位常见于负重的大关节（如膝、肘、踩、腕、骼、肩等）和肌肉/软组织，也可 表现为内脏出血(如腹腔内、腹膜后、泌尿、消化、呼吸道等）、皮肤、黏膜出血(如皮肤渺血、 鼻出血、口腔出血、牙銀出血等）。由于凝血因子VDKVDI因子)和凝血因子K(IX因子）的编码 基因位于X染色体上，因此大多数血友病患者分布于男性，男性人群中血友病A和B的发病率 分别约为1/5000和1/30000。其中，血友病A化emophilia A，HA)是最常见的X连锁隐性遗传 性出血性疾病，由于FVIII的遗传性缺陷或缺乏所致，从而引起凝血功能障碍，发病率在男 性中约为1/5000，女性通常为携带者，约60 %患者有遗传病家族史。患者常常发生自发性或 者外伤后出血不止，反复关节出血往往导致关节崎形，重要脏器出血可危及生命，目前尚无 有效的根治方法，患者主要输注FVIII制品或新鲜全血预防和治疗出血。由于HA的危害性、 遗传性及终生性，有必要开展HA的基因检测，为临床干预和遗传咨询提供依据。遗传学研究 表明血友病A主要由F8基因突变引起;该基因位于X性染色体长臂末端（（Xq28，ChrX: 154， 064,070-154,250,998，in hgl9)，其长度约有18化b并转录形成大约化b的mRNA;该基因含 有26个外显子(exon)，各外显子的大小不一，范围在69bp至3106bp之间。F8基因结构复杂， 突变种类多，包括基因点突变、缺失、插入和倒位等，可能设及整个基因，几乎覆盖了所有外 显子的区域，因此特异性检巧权8基因突变较为困难。很多年来，F8基因的复杂性导致很难对 F8基因进行有效地突变分析。直到1991年，Higuchi等人首次使用变性梯度凝胶电泳法 (denaturing gradient gel elec1:;rophoresis，DGGE) W分析F8基因的整个编码区，在29个 轻度或中度血友病A患者(包括15名德国人和14名日本人）中发现25名（86 % )患者F8基因致 病突变，而在重度血友病A患者中仅发现53%的患者F8基因致病突变。在1998年，Liu等首先 基于LD-PCR技术建立了Inv22突变检测方法，随后Bagnall等在2002年基于LD-PCR技术建立 了 Invl突变检测方法，运两种方法一直沿用至今。随后，多种突变筛查方法，如单链构象多 态性（single strand conformation polymorphism, SSCP)、构象敏感凝胶电泳 (conformation sensitive gel electrophoresis)、DGGE和化学裂解错配（chemical cleavage mismatch)分析方法，被使用于许多实验室。但运些分析方法仍只能检出的血友 病A患者中80-90 %的F8基因突变。对F8基因的直接测序(PCR扩增+Sanger测序），并且针对 血友病A患者的F8基因突变检出率可达97%。最近几年随着二代测序技术的发展，二代测序 技术也逐渐在各实验室使用并应用于血液疾病的遗传检测分析。目前，对PCR产物进行直接 Sanger测序是常用的F8基因检测方法，虽然该方法更为准确，但测序工作量巨大、效率低， 对操作人员要求较高，限制了该方法的大规模临床应用，仅能在有条件的实验室开展。
[0003] 当前，CN102230002A公开了一种检测血友病致病基因 F8基因和F9基因是否发生突 变的试剂盒，但其在扩增F8基因过程中所需要使用的引物组达24对，每对引物需要单独扩 增，虽然较为准确，但方法过于繁琐，反应体系需要后续纯化，再结合Sanger进行后续处理， 检测成本过高、效率低、分析困难。蔡晓红等(女性血友病A FVIII基因的双重杂合突变一例 基因分析，《血栓与止血学》，2005年，第11卷第02期，52-56页)采用的方法与CN102230002A 类似，也有类似的缺陷。
[0004] 第二代测序技术（next-generation sequencing,NGS)具有高通量、快速、准确和 成本低的优点，可实现多样本、多个基因、多外显子的同时检测。其中，Life Technologies 公司的Ion torrent PGM高通量测序平台是其中的代表，它是基于半导体忍片的新一代革 命性测序技术，使用一种布满小孔的高密度半导体忍片，一个小孔就是一个测序反应池；当 DNA聚合酶把核巧酸聚合到延伸中的DNA链上时会释放出一个H+，反应池中的pH值发生变 化，位于池下的离子感受器感受到此信号，把化学信号直接转化为数字信号，从而读出DNA 序列。Ion Torrent测序平台原理不同于其他第二代测序技术，不属于核酸标记、巧光检测 的生化技术，相比其他测序技术，更简单、经济，具有强大的扩展性。在上千万个纳米孔中， 同时对上百万的序列进行大规模平行测序，此项技术的产生摆脱了一代测序技术效率低， 费时费力的特点。因此，Ion torrent PGM测序技术可W对PCR产物进行直接测序，而不需要 片段化处理，而且采用标签技术，不需要对每个样本单独建库，可W显著提高检测通量，降 低单个样品的检测成本。目前还未有将多重PCR技术和Ion torrent PGM测序技术结合，并 将其应用于F8基因检测的研究。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了克服W上不足，将多重PCR技术和Ion torrent PGM测序技术 结合，并将其应用于F8基因检测。本发明通过设计了一组多重的引物，结合多重PCR技术，实 现了对F8基因26个外显子编码区的同步扩增富集，大大简化了实验操作;再结合标签技术， 使多个样本混合成一个文库通过Ion Torrent PGM测序文库构建环节同时处理，大大简化 了实验操作，最终每个样本的检测结果可W通过其独特的标签序列找回，实现多样本平行 测序，提高了检测效率，降低了检测成本。而在本发明的优化PCR引物设计，采用65个PCR反 应可W在单管中同步扩增获得F8基因全部外显子序列及侧翼内含子序列，与其它目标区域 捕获技术(如忍片捕获技术)相比，该方法操作更为简单，成本较低，而且结合Ion Torrent 半导体测序技术后更为节约了检测时间和检测成本，弥补了已有二代高通量测序方法工作 时间过长的缺陷
[0006] 本发明提供的技术方案为：
[0007] 用于多重PCR特异性扩增检测F8基因突变的引物组，所述PCR引物共65对，分别如 下：
[000引用于扩增F8基因外显子1和内含子1的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 1所示，反向 引物如沈Q ID NO:2所示；
[0009] 用于扩增F8基因内含子巧Ij外显子2的引物，其正向引物如SEQ ID N0:3所示，反向 引物如沈Q ID NO :4所示；
[0010] 用于扩增F8基因外显子巧Ij内含子2的引物，其正向引物如SEQ ID N0:5所示，反向 引物如沈Q ID NO:6所示；
[0011]用于扩增F8基因内含子巧IJ内含子3的引物，其正向引物如SEQ ID N0:7所示，反向 引物如沈Q ID NO:8所示；
[001引用于扩增F8基因内含子巧Ij外显子4的引物，其正向引物如SEQ ID N0:9所示，反向 引物如SEQ ID NO: 10所示；
[001引用于扩增F8基因外显子巧IJ内含子4的引物，其正向引物如SEQ ID N0:11所示，反 向引物如沈Q ID NO: 12所示；
[0014]用于扩增F8基因内含子巧IJ内含子5的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 13所示，反 向引物如沈Q ID NO: 14所示；
[001引用于扩增F8基因内含子巧IJ内含子6的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 15所示，反 向引物如沈Q ID NO: 16所示；
[0016]用于扩增F8基因内含子巧IJ外显子7的引物，其正向引物如SEQ ID N0:17所示，反 向引物如沈Q ID NO: 18所示。
[0017]用于扩增F8基因外显子巧IJ内含子7的引物，其正向引物如SEQ ID N0:19所示，反 向引物如SEQ ID NO: 20所示。
[0018]用于扩增F8基因内含子7到外显子8的引物，其正向引物如SEQ ID N0:21所示，反 向引物如SEQ ID NO: 22所示。
[0019]用于扩增F8基因外显子巧IJ内含子8的引物，其正向引物如SEQ ID N0:23所示，反 向引物如SEQ ID NO: 24所示。
[0020]用于扩增F8基因内含子8到外显子9的引物，其正向引物如SEQ ID N0:25所示，反 向引物如SEQ ID NO: 26所示。
[0021 ]用于扩增F8基因外显子巧IJ内含子9的引物，其正向引物如SEQ ID N0:27所示，反 向引物如SEQ ID NO: 28所示。
[0022] 用于扩增F8基因内含子9到外显子10的引物，其正向引物如SEQ ID N0:29所示，反 向引物如SEQ ID NO: 30所示。
[0023] 用于扩增F8基因内含子10到外显子11的引物，其正向引物如SEQ ID N0:31所示， 反向引物如SEQ ID NO: 32所示。
[0024] 用于扩增F8基因外显子11到内含子11的引物，其正向引物如SEQ ID N0:33所示， 反向引物如SEQ ID NO: 34所示。
[0025] 用于扩增F8基因内含子11到内含子12的引物，其正向引物如SEQ ID N0:35所示， 反向引物如SEQ ID NO: 36所示。
[0026] 用于扩增F8基因外显子12到内含子12的引物，其正向引物如SEQ ID N0:37所示， 反向引物如SEQ ID NO: 38所示。
[0027] 用于扩增F8基因内含子12到外显子13的引物，其正向引物如SEQ ID N0:39所示， 反向引物如SEQ ID NO:40所示。
[002引用于扩增F8基因外显子13到内含子13的引物，其正向引物如SEQ ID N0:41所示， 反向引物如SEQ ID N0:42所示。
[0029] 用于扩增F8基因内含子13到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:43所示， 反向引物如SEQ ID NO:44所示。
[0030] 用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:45所示， 反向引物如SEQ ID NO:46所示。
[0031 ] 用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:47所示， 反向引物如SEQ ID NO:48所示。
[0032] 用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:49所示， 反向引物如SEQ ID NO: 50所示。
[0033] 用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:51所示， 反向引物如SEQ ID NO: 52所示。
[0034] 用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:53所示， 反向引物如SEQ ID NO: 54所示。
[003引用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:55所示， 反向引物如SEQ ID NO: 56所示。
[0036] 用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:57所示， 反向引物如SEQ ID NO: 58所示。
[0037] 用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:59所示， 反向引物如SEQ ID N0:60所示。
[003引用于扩增F8基因外显