一种乙型肝炎病毒ymdd基因突变检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，属于基因检测领域。
【背景技术】
[0002] 我国2006年乙型肝炎流行病学调查表明，我国1-59岁一般人群HBsAg携带率为 7.18%，5岁W下儿童的皿SAg仅为0.96%。据此推算，我国现有的慢性乙型肝炎病毒感染者 约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。2013年乙型肝炎新增962,974例，占同年 病毒性肝炎的76.92 % ;死亡病例达550例，占同期病毒性肝炎死亡人数的74.42 %。乙肝不 仅严重影响人民身体健康，而且还造成了重大经济损失。据统计，我国每年因乙肝所致的直 接经济损失约300亿~500亿元。同时，由于我国的乙肝患者年龄大多在20~50岁之间，是社 会的中坚力量。因此，乙肝的预防与治疗具有重大的社会意义。随着社会进步和人民生活水 平的提高，我国政府对乙肝的预防与治疗日益重视，医疗保障体系覆盖率不断扩大，乙肝知 晓率和就诊率不断提高，乙肝用药市场保持了快速增长的势头。在各类乙肝用药中，抗病毒 类药物市场份额较大，且增长较快。2011~2013年，我国抗病毒类乙肝用药保持着19.90% 的复合增长率，2013年市场规模达到132.24亿元。在我国乙肝抗病毒用药市场中，阿德福韦 醋、恩替卡韦、拉米夫定等主要药品占有70%左右的市场份额。其中拉米夫定仍是销量较大 的一线用药，市场保有量很大。
[0003] 通过抗病毒药物的运用，乙型肝炎病毒已得到有效治疗。但是，长期单一治疗通常 不能完全抑制病毒的复制，而会出现耐药突变，拉米夫定耐药是抗病毒药物中最常见发生 的耐药突变药物。运种耐药突变主要是YMDD基序上的蛋氨酸(M)被异亮氨酸（I)和鄉氨酸 (V)替代的结果。当乙型肝炎病毒的YMDD突变为YIDD(204I)或YVDD(204V)时，就会发生拉米 夫定耐药。并随治疗时间延长而突变率逐渐增高，一般治疗1年的变异率为24%，2年约 38%，治疗3年后变异的发生率49%。而阿德福韦醋、恩替卡韦治疗3年后得变异分别只占到 11%和1.2%。耐药一旦发生，将极大降低乙型肝炎病毒对拉米夫定的敏感性，治疗效果显 著下降，抗病毒疗效将降低。乙型肝炎病毒的DNA会重新回升，部分患者会出现肝炎急性发 作，甚至肝功能失常因此。因此，通过检测YM孤的突变判断乙型肝炎病毒对拉米夫定的敏感 性，在指导患者临床用药，监控患者抗病毒疗效方面有重大意义。准确、简便的拉米夫定耐 药株检测对慢性乙型肝炎病人的疗程管理十分必要，能为临床用药能提供有力的证据。
[0004] 目前，对乙型肝炎病毒YMDD变异株的基因诊断方法中主要有DNA测序法，PCR-RFLP、聚合酶链反应-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)，基因忍片技术、烙解曲线分析法和实时 巧光定量PCR。其中DNA测序法是检测YMDD变异株的金标准，但其操作麻烦，耗时过长。PCR-RFLP和聚合酶链反应-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)虽然能较好的鉴别野生株和变异株，但 易产生污染而引起假阳性，另相对于巧光探针分析，在灵敏度及特异性上都有一定差异。基 因忍片技术具有高通量、快速、高灵敏等优势但其检测需要昂贵的仪器，专业的配套人员， 高昂的价格限制了临床诊断应用。烙解曲线分析法具有快速、方便、经济的特点，但此该法 的敏感度和特异性不高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提
[0006] 本发明采用了如下技术方案：
[0007] 本发明提供一种乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括:DNA 提取试剂，PCR反应预混液，热启动Taq酶、UDG酶，阳性质控品，W及阴性质控品，其中，所述 PCR反应预混液中具有上游引物：5' -CCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAG-3'，W及下游引物：5'-GGGACTCAAGATGTTGTACAGACTTGG-3' 〇
[0008] 进一步，本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可W具有运样的特 征:其中，所述DNA提取试剂成分为:莎梵婷，CTAB，乙醇，氯化钟。
[0009] 进一步，本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可W具有运样的特 征：其中，所述P C R反应预混液中具有第一探针：5 / -CCCCAATACCACATCATCAATATAACTGAAAGCCAGACAG-3'，其中 5'标记FAM基团，3'标记TAMARA基 团。
[0010] 进一步，本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可W具有运样的特 征：其中，所述P C R反应预混液中具有第二探针：5 / -CCCAATACCACATCATCCACATAACTGAAAGCCAGACAG-3'，其中5'标记CY5基团，3'标记TAMARA基 团。
[0011] 进一步，本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可W具有运样的特 征：其中，所述P C R反应预混液中具有第=探针：5 / -GCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCAC-3'，其中5'标记ROX基团，3'标记TAMARA基团。
[0012] 进一步，本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可W具有运样的特 征：制备阴性质控品，即野生型YMDD基因时所用的引物为：第一正向引物EWFl :5^-CTGCTCAAGGAACCTCTATGT-3'，第一反向引物EWRl: 5' -GACACACTTTCCAATCAATAGG-3'。
[0013] 进一步，本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可W具有运样的特 征：制备阳性质控品中的突变型YIDD基因片段时所用的引物为：第二正向引物EIFl: 5/-GGCTTTCAGTTATATTGATGATGTG-3'，第二反向引物EIRl: 5' -CACATCATCAATATAACTGAAAGCC-3'。
[0014] 进一步，本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可W具有运样的特 征：制备阳性质控品中的突变型YIDD基因片段时所用的引物为：第S正向引物EVFl: 5/-GCTTTCAGTTATGTGGATGATGTG-3'，第S反向引物EVRl: 5' -CACATCATCCACATAACTGAAAGC-3'。 [001引阳性质控品可采用I/V阳性血清或血浆对照。其为YMDD基因突变体YIDD和YVDD基 序中部分核酸片段连接到T载体，加入灭活皿V阴性血清或血浆为基质建立的模拟临床样 本。
[0016] 阴性质控品可采用灭活的皿V阴性血清或血浆。
[0017] 发明的有益效果
[0018] 本试剂盒和传统的诊断法比较，具有W下优势：
[0019] (1)检现幡度快；
[0020] (2)特异性好；
[0021 ] (3)灵敏度高;能够准确稳定的检测到I %的突变株。
[002引（4)重复性好；
[0023] (5)准确度高;能够准确区分YIDD和YVDD两种突变。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施实例，对本发明进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。
[0025] 本发明的乙型肝炎病毒YM孤基因突变检测试剂盒组成：
[0026] 每个试剂盒为48个反应，主要成分包括：
[0027] (I)DNA提取试剂
[0028] DNA提取试剂成分为：莎梵婷，0.1-0.5mmo 1/1;十六烷基S甲基漠化锭(CTAB)，1-2%;乙醇，0.5-1%;氯化钟，100-300臟〇1/1。
[0029] (2)巧光PCR试剂
[0030] 巧光定量PCR试剂成分为：乙型肝炎病毒YMDD基因突变PCR反应液（2 X ) ;480化的 IOXHot Start PCR缓冲液(热启动聚合酶链反应缓冲液），25mM MgC12;dNTP Mix 2.5mM; 上游引物HF, IOmM;下游引物皿，IOmM;探针PHI, I OmM;探针PHV，I OmM;探针PHW，IOmM;灭菌 d地20; hq DNA聚合酶 19.2uL; UDG酶9.6uL。
[0031] (3)质重巧制品
[0032] 质量控制品成分为：阳性对照品：I/V阳性血清或血浆模拟临床样本使用国家参考 品进行标定，浓度为lOOOIU/mL左右，lOmL。阴性对照品：灭活，HBV阴性血清或血浆临床样 本，lOmL。
[0033] 实施例2:乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒检测YMDD突变基因。
[0034] 具体方法为；
[0035] (1)质控品的构建:PCR(聚合酶链式反应)法
[0036] 模板DNA获得:采用皿V检测阳性的临床样本，提取DNA获得。
[0037] 需要合成的引物为：
[003引第一正向引物EWFl
[0039] 第一反向引物EWRl
[0040] 第二正向引物EIFl [0041 ] 第二反向引物EIRl
[0042] 第S正向引物EVFl
[0043] 第S反向引物EV