构建dna文库的试剂盒和方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及高通量测序文库构建领域，具体而言，设及一种构建DNA文库的试剂盒 和方法。
【背景技术】
[0002] 现在通用的小片段DNA文库构建方法主要是采用肥B的建库试剂盒，如NEBN设t? 叫tra?或者DNA Library Pr邱Kit for Illumina等，运些试剂盒基本上适用于所有的小 片段（180bp~5(K)bp)文库的构建，包括不同物种、不同质量或者不同的片段类型的样本。且 所构建的文库广泛应用于从头测序(denovo sequencing)或重测序(resequencing)等。
[0003] 上述试剂盒构建文库的主要流程如下：SI:对基因组进行片段化;S2:片段化DNA的 末端不是平末端，因此要对其进行补平(20°C30min)，补平后进行加 A(65°C30min); S3:采用 TA连接的方式加上一段固定的序列即U字型接头(20°C15min)，加入USER酶将U字型接头打 开(37°C 15min); S4:用AMPure XP磁珠进行片段选择，获得所需的加完接头的目的片段;S5: 目的片段进行PCR富集，PCR循环数可W根据模板量进行调节，一般6-15个循环;S6:最后用 AMPure XP磁珠纯化PCR产物后即可出库。
[0004] 但是，现有的NEB建库试剂盒在构建文库时存在下几个方面的缺点：（1)建库成本 较高:成品试剂盒价格一般比较贵，单次单一样本的建库成本在200元W上；（2)扩增效率比 较低:尤其是样本量比较低的样本，无法进行成功出库；（3)纯化步骤易出错:NEB的建库流 程在进行片段选择的时候通常经过2步磁珠纯化(分别去大片段和去小片段的方式），第1步 纯化是留上清溶液去掉吸附在磁珠上的大片段，第2步是去上清去掉小片段，2步磁珠纯化 的不同操作容易混淆；（4)磁珠纯化的选择性较差:磁珠选择的片段较宽，过宽的片段中会 有较大的片段，较大的片段在后续的PCR和簇生成的过程中处于劣势地位，最后可能导致数 据产出不足；（5)实验流程相对繁琐:肥的式剂盒中的接头是U型接头，在加完接头后会增加 一步添加 US邸酶将U型接头变为Y型接头的过程才可进行后续的PCR富集，实验流程相对繁 琐。
[000引因此，即使现有的试剂盒在构建文库方面有诸多优势，但仍具有上述诸多缺陷，因 而仍旧难W满足市场上对DNA文库构建多样化的需求。
【发明内容】
[0006] 本发明的主要目的在于提供一种构建DNA文库的试剂盒和方法，W解决现有技术 中的试剂盒扩增效率较低的问题。
[0007] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种构建DNA文库的试剂盒， 该试剂盒包括:酶试剂，酶试剂包括第一酶混液、T4 DNA连接酶W及第二酶混液，第一酶混 液由T4多聚核酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段^及巧曰9酶混合而成；第二酶混液为2X KAPA化Fi化*5*3的预混液；缓冲液，缓冲液包括第一酶混液所对应的第一缓冲液和T4 DNA连接酶所对应的第二缓冲液，第一缓冲液由IOX T4 DNA连接酶缓冲液、dNTP混合液W及 ATP混合而成;第二缓冲液由ATP、化is-HCl、MgCl2、阳G8000、Tween20W及二硫苏糖醇混合 而成；W及接头组合，接头组合包括接头序列组和标签序列组。
[000引进一步地，第一酶混液中，T4多聚核酸激酶的工作浓度为0.05~0.2UAiL，T4 DNA 聚合酶的工作浓度为0.02~0.04U/化，Klenow片段的工作浓度为0.0 l~0.0311/化，巧aq酶 的工作浓度为0.02~0.0411/化。
[0009] 进一步地，第一缓冲液中，IOX T4 DNA连接酶缓冲液的工作浓度为0.8X~2X，dNTP 混合液的工作浓度0.3~0.6mM; ATP的工作浓度为1.5~2.2mM。
[0010] 进一步地，第二缓冲液中，ATP的工作浓度为1.5~3mM，Tris-HCl的工作浓度为 0.04~0.08M，MgCl2的工作浓度为0.01~0.03M，PEG8000的工作浓度为5%~10wt%，Tween 20的工作浓度为Iv%~4v%，二硫苏糖醇的工作浓度为0.0 Ol~0.003M。
[0011] 进一步地，T4 DNA连接酶的工作浓度为200~SOOUAiL ;2X KAPA HiFi HotStart预 混液的工作浓度为IX。
[0012] 进一步地，接头组合形成Y型接头;优选接头序列组由第一接头序列和第二接头序 列按照等摩尔比混合而成，标签序列组由标签序列与通用引物按照等摩尔比混合而成。
[0013] 进一步地，第一接头序列为SEQ ID N0:1所示的
,第二接头序列为：SEQ ID N0:2所示的 N0:1和沈QIDN0:2中的N为A、T、C或G中的 任何一种;标签序列包括SEQ ID NO:3所示的第一标签序列、SEQ ID NO:4所示的第二标签 序、SEQ ID N0:5所示的第S标签序列、SEQ ID N0:6所示的第四标签序列、SEQ ID N0:7所 示的第五标签序列、SEQ ID NO:8所示的第六标签序列、SEQ ID NO:9所示的第屯标签序列、 SEQ ID NO: 10所示的第八标签序列、SEQ ID NO: 11所示的第九标签序列W及SEQ ID NO: 12 所示的第十标签序列;通用引物为SEQ ID N0:13所示的序列。
[0014] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种上述任一种试剂盒构建 DNA文库的方法，该方法包括:对样本的基因组DNA进行片段化，得到DNA片段;利用第一酶混 液和第一缓冲液对DNA片段进行末端修复及加 A，得到修复片段;利用T4 DNA连接酶、第二缓 冲液W及接头引物组对修复片段进行接头连接，得到带接头片段;利用第二酶混液和标签 序列组对带接头片段进行PCR富集，得到DNA文库。
[0015] 进一步地，在得到带接头片段的步骤后，W及在对带接头片段进行PCR富集之前， 方法还包括对带接头片段进行纯化的步骤。
[0016] 进一步地，纯化的步骤包括依次进行磁珠纯化和电泳纯化的步骤。
[0017] 应用本发明的技术方案，通过选择市售的T4多聚核酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow 片段并混合成第一酶混液，然后与市售的IOX T4 DNA连接酶缓冲液、dNTP混合液W及ATP混 合而成的第一缓冲液配合使用，不仅同样能够实现片段化DNA的末端修复和加 A，而且降低 构建成本。而采用市售的T4 DNA连接酶及由上述试剂组成的第二缓冲液对修复后的DNAW 及接头进行接头连接，能够提高接头连接效率。最后，利用2X KAPA化Fi化tStad预混液 对连上接头的产物进行扩增富集，扩增效率高。因而，采用本发明的上述试剂盒，不仅能够 降低文库构建成本，而且能提高扩增效率。
【附图说明】
[0018] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0019] 图1示出了根据本发明的优选实施例中DNA文库构建流程图；
[0020] 图2示出了本发明一种优选的实施例中所构建的DNA文库的检测结果图；W及
[0021] 图3示出了本发明一种优选的实施例中所构建的另一 DNA文库的检测结果图。
【具体实施方式】
[0022] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可W相 互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0023] 需要说明的是，本发明所述的各种市售试剂不包括现有市场上用于文库构建的整 套试剂盒或者试剂盒中的某种单一试剂，而是指W单独形式售卖的试剂。
[0024] 本发明中，M为摩尔浓度mol/L的简写，mM为摩尔浓度mmol/L的简写，JiM为摩尔浓度 皿ol/L的简写。
[002引 IOX T4 DNA连接酶缓冲液是700mm Tris-肥KP册.0)，IOOmm MgC12和50mm DTT; 其中，工作浓度IX的意思是：70mM Tris-肥1 (P册.0)，IOmM MgCl巧化mMDTT;0.5X的工作浓 度的意思是：35mM Tris-HCKP册.0)，5mM MgC12和2.5mM DTT。由于在进行试剂配置时，用 的是商业化的IOX T4 DNA连接酶缓冲液，因此，在后面的用到的试剂中提及的就是IOX T4 DNA连接酶缓冲液。
[0026] 2X KAPA化Fi化预