一种丙氨环丙沙星半抗原及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种环丙沙星抗原的制备方法及其应 用。
【背景技术】
[0002] 环丙沙星(Cipr〇fl〇Xacin，CIP)属于第三代氟喹诺酮类药物，是一种常用广谱抗 生素类药物，常作为抗菌剂广泛地应用于畜禽细菌性传染病的预防及治疗。但过量使用或 滥用可导致该药物在动物源性食品中残留，从而对人类健康造成严重的威胁。因此世界各 国对环丙沙星以及其他氟喹诺酮类药物的的残留限量越来越严格，我国农业部最新修订的 《动物性中食品中兽药最高残留限量》中规定牛、羊等的奶中及所有食品动物的肌肉、脂肪、 肝、肾脏中所有环丙沙星药物的最高残留限量lOOppb。目前，应用于环丙沙星与其他喹诺酮 类药物检测的常用方法有高效液相色谱(HPLC)、GC/MS、LC/MS与ELISA。免疫分析具有灵敏、 快速、操作简单、特异性高的特点，在高通量药物残留筛选技术领域占据极为重要的地位。 而免疫分析方法过程中，抗原的制备又是最为关键的一个步骤。
[0003] 由于环丙沙星分子量较小，必须将其与载体偶联形成完全抗原后才能制备相应抗 体，因此，合成高质量的免疫原是小分子物质免疫分析的关键。合成免疫原一般采用化学方 法使半抗原与载体蛋白偶联
【发明内容】
[0004] 本发明提供了式（I)所示的丙氨环丙沙星化合物、其制备方法、以及式（I)化合物 作为半抗原/中间体，以用于制备环丙沙星包被抗原的用途和方法。
[0005]
[0006] 具体公升J式（1)化合物的制爸万法包谷以卜步骤：
[0007] (1)取盐酸环丙沙星0.33g，溶于1 OmlN，N-二甲基甲酰胺溶液中，80 °C搅拌；
[0008] (2)逐滴加入氢溴酸3-溴丙氨0.26g，80°C搅拌3h;
[0009] (3)将步骤(2)制备得到的反应液减压蒸馏，得到式(I)化合物。
[0010] 以及进一步的，通过制备液相色谱对式(I)进行纯化的方法;其中制备液相色谱的 色谱条件为色谱柱尺寸为150_ X 4.6mm，色谱柱的固定相填充颗粒的粒径为3.5um;流动相 流速 1 .OmL/min，柱温40°C ;
[0011] 所述制备色谱色谱的流动相为乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液：以体积百分比 计，1 - 9分钟为5 % -95 %的乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液，9 -14分钟为95 %的乙腈的 三氟乙酸水溶液，14-15分钟为95% - 5%的乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液，其中所述 三氟乙酸水溶液为含体积浓度0.01 %的三氟乙酸的水溶液；收集制备液相色谱柱的流出 液，得纯化的式(I)化合物。
[0012] 本发明公开了式（I)化合物用于制备环丙沙星包被抗原的用途，即作为制备环丙 沙星包被抗原的中间体，或者作为制备环丙沙星包被抗原的半抗原，以制备环丙沙星-丙 氨-牛血清蛋白、环丙沙星-丙氨-卵清蛋白的用途。
[0013] 具体的，本发明所述的式(I)化合物制备环丙沙星-丙氨-牛血清蛋白或环丙沙星-丙氨-牛血清蛋白抗原的用途，在于所述制备方法包含以下步骤：
[0014] (1)取式（I)化合物0 · 10g，溶于5mL 0 ·6mol/L的盐酸溶液中，加入30mg锌粉，80°C 水浴锅加热30min，得溶液A;
[0015] ⑵称取1 〇〇mg牛血清蛋白溶解于2mL的0.02mo 1/L的磷酸盐缓冲液中，得溶液B;
[0016] (3)将溶液A缓慢滴加到溶液B中充分混合，滴加体积浓度25 %的戊二醛水溶液 0. lml，室温搅拌6小时；混合液装入透析袋，PH值7.4的0 . Olmol/L的磷酸盐缓冲液液4°C透 析72小时，得环丙沙星-丙氨-牛血清蛋白。
[0017] 同时，本发明提供了一种制备环丙沙星-丙氨-牛血清蛋白的方法，包含以下步骤：
[0018] (1)取式（I)化合物0 · 10g，溶于5mL 0 ·6mol/L的盐酸溶液中，加入30mg锌粉，80°C 水浴锅加热30min，得溶液A;
[0019 ] ⑵称取1 〇〇mg牛血清蛋白溶解于2mL的0.02mo 1/L的磷酸盐缓冲液中，得溶液B;
[0020] (3)将溶液A缓慢滴加到溶液B中充分混合，滴加体积浓度25 %的戊二醛水溶液 0. lml，室温搅拌6小时；混合液装入透析袋，PH值7.4的0.01m〇l/L的磷酸盐缓冲液液4°C透 析72小时，得环丙沙星-丙氨-牛血清蛋白。
[0021] 进一步的，本发明公开了上述制备方法得到的环丙沙星-丙氨-牛血清蛋白产品， 及环丙沙星-丙氨-牛血清蛋白包被抗原；以及以所述环丙沙星-丙氨-卵清蛋白作为抗原免 疫新西兰兔制备环丙沙星抗体、进而制备环丙沙星检测试剂盒的用途。
[0022] 此外，本发明还具体的提供了所述的式（I)化合物制备环丙沙星-丙氨-卵清蛋白 或环丙沙星-丙氨-卵清蛋白抗原的用途，在于所述制备方法包含以下步骤：
[0023 ] (1)式（I)化合物0.10g，溶于N，N-二甲基甲酰胺，得溶液C;
[0024] (2)取1-(3 -二甲氨基丙基）-3 -乙基碳二亚胺盐酸盐30mg，溶于4mL蒸馏水，缓慢滴 加至溶液C中，室温搅拌24小时，得溶液D;
[0025] (3)将步骤(2)制备的溶液D离心，取上清液，缓慢滴加至5mL含50mg卵清蛋白的碳 酸钠缓冲水溶液中，所述碳酸钠缓冲水溶液的浓度为〇. lmol/L，4°C搅拌72小时，得环丙沙 星-丙氨-卵清蛋白。
[0026] 同时，本发明提供了一种制备环丙沙星-丙氨-卵清蛋白的制备方法，包含以下步 骤：
[0027] (1)式（I)化合物0.10g，溶于N，N-二甲基甲酰胺，得溶液C;
[0028] (2)取1-(3 -二甲氨基丙基）-3 -乙基碳二亚胺盐酸盐30mg，溶于4mL蒸馏水，缓慢滴 加至溶液C中，室温搅拌24小时，得溶液D;
[0029] (3)将步骤(2)制备的溶液D离心，取上清液，缓慢滴加至5mL含50mg卵清蛋白的碳 酸钠缓冲水溶液中，所述碳酸钠缓冲水溶液的浓度为〇. lmol/L，4°C搅拌72小时，得环丙沙 星-丙氨-卵清蛋白。
[0030] 进一步的，本发明公开了上述制备方法得到的环丙沙星-丙氨-卵清蛋白，或作为 环丙沙星-丙氨-卵清蛋白抗原和环丙沙星-丙氨-卵清蛋白包被抗原；以及以所述环丙沙 星-丙氨-卵清蛋白作为抗原免疫新西兰兔制备环丙沙星抗体，进而制备环丙沙星检测试剂 盒的用途。
[0031] 本发明合成了丙氨环丙沙星半抗原，经过ESI-MS、IR和1H-NMR与 13C-匪R对合成的 半抗原进行了确证，为进一步建立的ELISA检测方法提供了必要的半抗原结构信息。该半抗 原可利用其远离抗原决定簇结合位点的-NH 2与蛋白载体上氨基的偶联，制备出理想的人工 抗原。
[0032] 同时，本发明合成了环丙沙星-丙氨-卵清蛋白抗原，以及环丙沙星-丙氨-牛血清 蛋白抗原，并通过紫外吸收光谱法鉴定了结构。可将本发明制备的人工抗原免疫新西兰白 兔，获得环丙沙星抗体，以制备环丙沙星检测试剂盒。
[0033]抗体通常对远离联结位点的半抗原部分具有较好的识别能力，因此半抗原与载体 蛋白的偶联位置最好远离重要的抗原决定簇。环丙沙星母环上的6位F原子、4位羰基和3位 羧基官能团是抗体识别过程中起重要作用的部分，在哌嗪环上链接一个侧链，使偶联位置 远离抗原决定簇有利于获得效价高、特异性好的抗体。因此，在制备环丙沙星免疫原的过程 中，我们保留了环丙沙星的的6位F原子、4位羰基和3位羧基官能团。本发明通过在远离6位 F、4位羰基和3位羧基官能团的哌嗪环位点链接一个侧臂(又称间隔臂)后得到半抗原后，再 制备环丙沙星抗原。
[0034]包被抗原中的半抗原和蛋白载体(BSA、0SA等）间的间隔臂长度对特异性抗体的产 生有较大影响，选择适当的间隔臂可进一步促进免疫系统对半抗原部分的识别，进而产生 更高特异性的抗体。本发明的合成包被原，由于选择了恰当的间隔臂形式(丙氨）制备得到 了半抗原，以及采用特定的制备包被抗原的方法，这与直接使用环丙沙星制备得到的包被 抗原、以及与环丙沙星其他形式的半抗原制备得到的包被抗原相比，经过免疫新西兰兔，得 到了专属性和灵敏度更高的抗血清和抗体，显著提高了ELISA检测的准确度和灵敏度。 [0035] 说明书【附图说明】：
[0036]图1丙氨环丙沙星的红外光谱
[0037]图2:丙氨环丙沙星的电喷雾质谱图谱(ESI-MS)
[0038]图3:丙氨环丙沙星的碎片m/z389的电喷雾质谱图谱(ESI-MS)
[0039] 图4丙氨环丙沙星的1H-核磁共振图谱PH-NMR)
[0040] 图5丙氨环丙沙星的13c-核磁共振图谱(I3c--NMR)
[0041] 图6:环丙沙星-丙氨、环丙沙星-丙氨-牛血清蛋白、牛血清蛋白的紫外吸收光谱
[0042] 图7:环丙沙星-丙氨、环丙沙星-丙氨-卵清蛋白、卵清蛋白的紫外吸收光谱 [0043]以下为【具体实施方式】
[0044]实施例1、丙氨环丙沙星的制备
[0045] 取盐酸环丙沙星0.33g(lmmol)，溶于lOmlDMF溶液中，80°C搅拌溶解，逐滴加入氢 溴酸3-溴丙氨0.26g(l.2mmol)，80°