OsQR1蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种OsQRl蛋白及其编码基因与应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 非生物逆境是影响植物正常生长发育，限制着作物产量提高的主要胁迫因子。目 前，干旱对世界作物产量的影响，居于各胁迫因素的首位，其对作物生长的危害相当于所有 自然灾害之和，在许多地方已经成为农业发展的瓶颈。水稻是世界上的主要粮食作物之一， 是我国60%以上人口的主粮。据统计，水稻用水占农业用水的70%左右，我国水稻栽培面 积从1997年以来持续缩减，并且每年还有2千多万亩水稻受旱，甚至还有上千万亩水稻无 法种植。因此，克服干旱逆境胁迫对植物的伤害，创制抗旱植物新种质、选育抗旱品种、改良 农作物的耐旱性，已成为近年来植物抗旱遗传育种研究的热点之一。
[0003] 利用传统育种方法培育抗旱水稻品种周期长、偶然性大，所培育的品种不稳定，进 展比较缓慢，而利用基因工程技术可以直接在基因水平上改造植物的遗传背景，定向改造 植物的遗传性状。外源基因的转入丰富了基因资源，弥补了常规育种方法的不足，是抗旱品 种选育的有效途径之一。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种OsQRl蛋白及其编码基因与应用。
[0005] 本发明提供一种蛋白，为如下⑴或（2)所示：
[0006] (l)SEQ ID No. 4 所示的蛋白；
[0007] (2)将SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
[0008] 上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
[0009] 上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：
[0010] 1) SEQ ID No. 3 所示的 DNA 分子；
[0011] 2) SEQ ID No. 3中自5'末端起第79位至第690位核苷酸所示的DNA分子；
[0012] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0013] 4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的 DNA分子。
[0014] 含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于 本发明的保护范围。
[0015] -种制备转基因植物的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将上述任 一所述编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的耐旱性 和/或渗透压耐性增强。
[0016] 上述方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将 所述编码基因插入出发载体PMDC83的PacI和SacI位点间得到的。
[0017] 上述任一所述的方法中，所述植物为水稻。
[0018] 上述蛋白、上述任一所述的编码基因在增强植物耐旱性中的应用也属于本发明的 保护范围。
[0019] 上述蛋白、上述任一所述的编码基因在增强植物渗透压耐性中的应用也属于本发 明的保护范围。
[0020] 上述任一所述的应用中，所述植物为水稻。
[0021] 本发明提供的OsQRl蛋白及其编码基因为水稻抗旱分子育种提供了新基因和新 材料，对改良水稻及其他作物的抗旱具有重要意义。
【附图说明】
[0022] 图1为实时荧光定量PCR分析旱稻IRAT109和水稻品种日本晴内源OsQRl基因的 相对表达量结果。
[0023] 图2为PCR鉴定T。代转OsQRl基因的水稻植株。
[0024] 图3为转OsQRl基因的水稻植株的实时荧光定量PCR检测结果。
[0025] 图4为转OsQRl基因的水稻苗期PEG模拟断水胁迫实验结果。
[0026] 图5为转OsQRl基因的水稻苗期培养基模拟渗透胁迫实验结果。
[0027] 图6为转OsQRl基因的水稻苗期盆栽抗旱性鉴定结果。
【具体实施方式】
[0028] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0029] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030] 旱稻 IRAT109 (Oryza. sativa L. ssp. japonica)在文献"夏志宏·优质粳型旱稻 IRAT109及其栽培技术.安徽农业.1994年06期."中公开过，公众可从中国农业大学获 得。
[0031] 水稻日本晴（Oryza. sativa L. ssp. japonica)在文献"水稻品种"日本晴" ·农业 科技通讯.1973年02期"中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0032] 载体pMDC83在文献"Mark D. Curtis and Ueli Grossniklaus. A Gateway Cloning Vector Set for High-Throughput Functional Analysis of Genes in Planta. Plant Physiology, 2003, 133 (2) : 462-469"中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0033] 根癌农杆菌EHA105在文献"高世武等.影响根癌农杆菌EHA105感受态细胞转化 效率因素的研究.热带生物学报.2012年3月第3卷第1期"中公开过，公众可从中国农业 大学获得。
[0034] 实施例1、旱稻抗旱性相关蛋白OsQRl编码基因的获得
[0035] 一、取正常条件下培养的旱稻IRAT109幼苗的叶片，Trizol法提取总RNA，并用 M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA。
[0036] 二、以步骤一得到的cDNA为模板，用引物F1和引物R1进行PCR扩增，得到PCR扩 增产物。
[0037] 引物序列如下：
[0038] F1:5,-GTTAATTAA CAATGGCGGTGAAGGTCT-3'（SEQ ID No. 1)
[0039] (下划线所示序列为限制性内切酶PacI的酶切识别位点）
[0040] R1:5,-CGAGCTC TCAAGCGGACCCCTTGA-3,（SEQ ID No. 2)
[0041] (下划线所示序列为限制性内切酶SacI的酶切识别位点）
[0042] 三、将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化629bp的DNA片段进行测序， 目的片段中含有的基因序列如SEQ ID No. 3中自5'末端起第79位至第690位核苷酸所示， 该基因为OsQRl基因，其编码的OsQRl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID如.4所示，0抑1?1基因 的全长cDNA序列如SEQ ID No. 3所示。
[0043] 实施例2、实时荧光定量PCR分析内源OsQRl基因的表达
[0044] 一、胁迫处理
[0045] 将水培的苗龄为4周的水稻品种日本晴和旱稻品种IRAT109幼苗，分别进行以下 (一）至（四）的任一处理：
[0046] (一）ΑΒΑ处理：将幼苗根部浸泡于100 μ Μ的ΑΒΑ的水溶液中，光照培养1小时、4 小时、6小时、8小时、9小时、16小时、24小时后取叶片，用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0047] (二）H202处理：将幼苗根部浸泡于ImM H202水溶液中，放置1小时、3小时、6小时、 8小时、9小时、16小时、24小时后取叶片，用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0048] (三）PEG (干旱）处理：将幼苗根部浸泡于200g/L的聚乙二醇（PEG6000)水溶液 浸泡1小时、2小时、3小时、8小时、12小时、16小时、24小时后取叶片，用液氮速冻，-80°C 保存备用。
[0049] (四）NaCl处理：将幼苗根部浸泡于200mM NaCl的水溶液中，浸泡1小时、3小时、 6小时、8小时、16小时、24小时、36小时后取叶片，用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0050] 对照组的处理：直接取未经任何处理的水培的苗龄为4周的水稻品种日本晴和旱 稻品种IRAT109幼苗叶片-80°C冻存作为对照。
[0051] 二、实时荧光定量PCR
[0052] 取步骤一获得的各处理组以及对照组的叶片，分别提取其总RNA，利用 反转录酶M-MLV反转录合成cDNA第一链，以该cDNA第一链为模板，采用引物 5'-ATGGCGGTGAAGGTCTA-3'（S