一种抗氟磺胺草醚相关蛋白hb1及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗氟磺胺草醚相关蛋白HB1及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，我国玉米种植面积不断增加，现今玉米已经成为我国种植面积最大的谷 类作物。随着玉米种植面积的增加，除草剂也已成为玉米田杂草防除中不可缺少的部分，但 由于我国农民施药技术水平低，喷洒器械落后等原因，已造成除草剂应用剂量过大，土壤积 累量增高，严重影响到后茬作物的轮作，给农业生产造成严重损失，并严重影响了我国农业 种植业结构的调整。目前，随着氟磺胺草醚施用面积的扩大，氟磺胺草醚残留对后茬玉米造 成药害日趋严重，解决氟磺胺草醚残留药害，并已成为一个亟待解决的生产问题和环保问 题。
[0003] 现今，生物技术的发展已经引起了农业领域的重大变革，利用外源基因导入植物 体中并进行表达，给作物育种带来了革命性的变化。因此，利用生物工程技术摆脱传统杂交 育种的物种局限培育对氟磺胺草醚具有抗性的作物新品种，既可以充分利用基因资源、自 由构建遗传性状，也可以减少氟磺胺草醚对后茬玉米的药害。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种抗氟磺胺草醚相关蛋白HB1及其编码基因与应用。
[0005] 本发明提供了一种蛋白，获自玉米，命名为HB1蛋白，是如下(a)或(b):
[0006] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0007] (b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与氟磺胺草醚抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0008] 为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的 蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0009] 表1标签的序列 「00101 LUU11J 上还（b)中的蛍日质~人丄甘成，也
~无甘成共綱妈.凶，冉进仃生物表达得到。 上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个 氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端 连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0012]编码所述HB1蛋白的基因（HB1基因）也属于本发明的保护范围。
[0013]所述基因可为如下（1)或(2)或(3)的DNA分子：
[0014] (1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
[0015] (2)在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且编码氟磺胺草醚抗性相关蛋白的 DNA分子；
[0016] (3)与（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 %或至少具 有99%同源性且编码与氟磺胺草醚抗性相关的蛋白的DNA分子。
[0017] 所述严格条件可为如下:在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2 X SSC，0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0 · 1 % SDS各洗膜一次。
[0018] 含有所述HB1基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保 护范围。
[0019] 所述重组载体具体可为将所述HB1基因插入PACYC184载体得到的重组质粒。所述 重组载体具体可为将所述HB1基因插入pACYC184载体的BamM酶切位点得到的重组质粒。
[0020] 所述重组菌可为将所述重组载体导入宿主菌得到的重组菌。所述宿主菌可为大肠 杆菌，具体可为大肠杆菌JM109。
[0021] 本发明还保护一种培育重组微生物的方法，包括如下步骤:将所述HB1基因导入出 发微生物，得到对氟磺胺草醚抗性高于所述出发微生物的重组微生物。所述HB1基因具体可 通过以上任一所述重组载体导入所述出发微生物。所述出发微生物可为细菌，具体可为大 肠杆菌，更具体可为大肠杆菌JM109。
[0022]本发明还保护一种培育重组微生物的方法，包括如下步骤:将所述HB1基因导入出 发微生物，得到对氟磺胺草醚的降解能力高于所述出发微生物的重组微生物。所述HB1基因 具体可通过以上任一所述重组载体导入所述出发微生物。所述出发微生物可为细菌，具体 可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌JM109。
[0023] 本发明还保护所述HB1蛋白或所述HB1基因的应用，为如下（cl)、（c2)、（C3)、（C4)、 (c5)和(c6)中的至少一种：
[0024] (cl)调控植物或微生物对氟磺胺草醚的抗性；
[0025] (c2)增加植物或微生物对氟磺胺草醚的抗性；
[0026] (c3)培育对氟磺胺草醚抗性增高的植物或微生物；
[0027] (c4)调控植物或微生物对氟磺胺草醚的降解能力；
[0028] (c5)增加植物或微生物对氟磺胺草醚的降解能力；
[0029] (c6)培育对氟磺胺草醚降解能力增高的植物或微生物。
[0030]所述微生物可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌JM109。
[0031]目前，玉米种植面积增加，氟磺胺草醚残留药害问题对玉米种植产业的影响越来 越大。本发明的发明人通过构建基因组文库，从玉米中发现了抗氟磺胺草醚相关蛋白及其 编码基因，为转基因植物或转基因微生物的研究提供重要的基因资源，可用于培育抗氟磺 胺草醚的转基因作物品种或转基因微生物，具有很高的应用价值。
【附图说明】
[0032]图1为实施例3的结果。
[0033]图2为实施例4的结果。
【具体实施方式】
[0034]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。PACYC184质粒:Fermentas公司。大肠杆菌JM109:天根生化科技有限公司。氟磺胺草 醚:江苏常青农药有限公司。
[0035]氟磺胺草醚的结构式如下：
[0036]
[0037] 采用高效液相色谱检测氟磺胺草醚浓度。以氟磺胺草醚浓度为x(mg/L)，以峰面积 为y，制作标准曲线。氟磺胺草醚浓度在〇 . 〇l-5mg/L范围内，标准曲线方程为y = 22085x+ 1276.9。氟磺胺草醚浓度在7.5-40mg/L范围内，标准曲线方程为y = 20620x+l 1511。
[0038] 实施例1、抗氟磺胺草醚蛋白及其编码基因的发现
[0039] 1、基因组DNA的提取
[0040] 取玉米自交系Lx347的种子，先用60°C温水浸泡30min，再用0.6%多菌灵溶液浸泡 30min，用蒸馏水冲洗干净后用安全剂NA(将商品药NA稀释200倍后使用)浸种12h，用蒸馏水 清洗干净后置于温度26.5 °C、湿度75 %的培养箱内，催芽24h。
[0041] 取过20目筛的黑土，加入氟磺胺草醚并使其浓度为0.4mg/L，得到毒土。将lkg毒土 平均装入3个盆中，每个盆播种7粒种子(脐部朝下），置于人工气候培养箱内（温度27°C、湿 度75%、光照8小时/黑暗16小时)培养。
[0042] 播种7天后，米用Fermentas公司GenomicDNA puritication kit提取基因组DNA。
[0043] 2、用限制性内切酶BamM酶切pACYC184质粒，回收约4.2kb的片段并进行去磷酸 化。
[0044] 3、用限制性内切酶Sau3AI酶切步骤1得到的基因组DNA，回收l-6kb的片段。
[0045] 4、将步骤3回收的各个片段分别与步骤2的产物连接，然后将连接产物转化大肠杆 菌JM109,得到各个重组菌。
[0046] 5、将步骤4得到的各个重组菌分别划线于含5000mg/L、8000mg/L、10000mg/L、 15000mg/L或20000mg