一种组织蛋白酶b可裂解的嵌段聚合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药技术、纳米医药及新材料领域，具体涉及以组织蛋白酶B(CB)可降解的嵌段聚合物的合成及其组装方法、以及应用于制备对肿瘤细胞具有增强的细胞内药物控制释放特性的智能纳米胶束载体的用途。
【背景技术】
[0002]通常细胞毒性药物是一类可有效杀伤免疫细胞并抑制其增殖的药物，可用于抗恶性肿瘤，也可用作免疫抑制剂，是化疗的主要用药，主要通过毒化某些快速增长和分裂的细胞来治疗癌症。这类药物因具有致癌、致畸、生殖毒性以及低剂量时致系列器官毒性等毒副作用，从而影响了其临床疗效的发挥。纳米药物载体为实现细胞毒药物在肿瘤组织内的定点和快速释放，减少对正常组织器官的损伤，避免有效药物剂量不足导致肿瘤细胞产生耐药性提供了一个有效途径。智能纳米药物载体系统主要是基于肿瘤组织与人体正常组织的微环境差异，如肿瘤组织具有乏氧、酸性PH值、温度稍高、有大量生长因子及水解蛋白酶等特点。利用实体瘤的高渗透和长滞留效应(EPR效应)，可使纳米载体药物在肿瘤组织富集，在肿瘤微环境作用下快速解体，迅速释放出抗肿瘤药物“杀死”肿瘤细胞。
[0003]CB是溶酶体内半胱氨酸蛋白水解酶，其催化作用由Cys，Hi s实现，属于木瓜蛋白酶家族，在pH3.0-7.0都具有活性，碱性条件下会不可逆失活，其水解位点为-Arg-Arg-/-Xaa，且能够在羧基端按顺序水解二肽，因此也叫作羧基二肽酶。通常认为CB在溶酶体降解蛋白质过程中发挥着必不可少的作用，可以降解多种蛋白质。利用原位杂交、Western blot及免疫组化等技术研究发现，胃癌、肺癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤组织中，CB的表达及CB活性均成倍甚至3-9倍高于邻近正常组织。利用CB可以选择性地降解一些多肽片段的特点，可以构建CB敏感的药物传递系统。
[0004]Jan Feijen等利用CB敏感的四肽Gly-Phe-Leu-Gly为连接键合成了一种CB可降解的囊泡，并证明了在CB存在的条件下，由于四肽连接键的断裂使囊泡的外壳解体，从而导致了药物的快速释放。而没有CB存在时，囊泡保持稳定。本发明人也曾合成一种以CB可降解的二肽Val-Cit为连接键的嵌段聚合物，但实验表明其释药速率较慢。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明提供了一种CB可裂解的嵌段聚合物，所述嵌段聚合物以二肽和PABOH为连接键。本发明制备的嵌段聚合物可以用于构筑纳米胶束，具有较好的释药性和较低的细胞毒性。
[0006]本发明提出了一种组织蛋白酶B(CB)可裂解的嵌段聚合物，所述嵌段聚合物是以CB敏感的二肽和PABOH作为连接键。优选地，以-Val-Cit-PABC-为连接键，其结构如式(I)所示:
[0007]mPEG-Val-Cit-PABC-R2 式(I);
[0008]式(I)中，mPEG为甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物，R2为直链脂肪胺。
[0009]优选地，所述嵌段聚合物的结构如式(II)所示:
[0010]mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn 式(II);
[0011]其中，mPEG甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物，平均分子量为1000-10000，Cn表示碳原子数，η为14-22。
[0012]本发明还提供了一种组织蛋白酶B(CB)敏感的嵌段聚合物的制备方法，该方法将连接键Val-Cit-PABC-PNP先与长链脂肪胺Cn-NH2反应制得Val-Cit-PABC-NH-Cn后再与甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物反应得到mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn。所述mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn的制备方法包括以下步骤:(I )Fmoc保护的连接键Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP与长链脂肪胺Cn-NH2在DMAP的催化作用下反应制得Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn; (2)在哌啶的作用下Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn脱去Fmoc的保护制得Val-Cit-PABC-NH-Cn; (3)脱保护后的Val-Cit-PABC-NH-Cn与甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物经过脱水缩合反应制得mPEG-Val-Cit-PABC-Cnο其中，mPEG为甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物，平均分子量为1000-10000，Cn表示碳原子数，η为14-22。
[0013]所述步骤(I)中，在二氯甲烷中室温下反应36小时。
[0014]所述步骤(2)中，反应溶剂为二甲基甲酰胺，反应温度为室温，反应时间为2小时。
[0015]所述步骤(3)中，脱保护后的Val-Cit-PABC-NH-Cn与甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物在二甲基甲酰胺中，在室温下条件下，与EDC1、H0Bt和Et3N反应，经过脱水缩合反应24小时，制得 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn。
[0016]进一步地，本发明的mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn的制备方法，包括I )Fmoc保护的连接键Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP与长链脂肪胺Cn-NH2在DMAP的催化作用下，于二氯甲烷中室温下反应36小时，反应制得Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn; (2)将Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn溶解在二甲基甲酰胺中，加入哌啶，室温下反应2小时后，Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn脱去Fmoc的保护制得Val-Cit-PABC-NH-Cn; (3)脱保护后的Val-Cit-PABC-NH-Cn与甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物mPEG在二甲基甲酰胺中与EDC1、H0Bt和Et3N反应24小时，经过脱水缩合反应制得mPEG-Val-Ci t-PABC-Cn。其中，mPEG为甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物，平均分子量为1000-10000，Cn表示碳原子数，η为14-22。
[0017]本发明进一步提出了将所述嵌段聚合物用于制备药物载体的应用。所述嵌段聚合物以CB敏感的二肽和PABOH为连接键。所述嵌段聚合物包括式(I)、式(II)。
[0018]其中，所述药物为脂溶性药物;所述脂溶性药物包括抗肿瘤药物;所述抗肿瘤药物包括SN-38、喜树碱、紫杉醇、顺铂、阿霉素等。
[0019]其中，所述载体为纳米胶束载体，优选地，所述纳米胶束载体为CB敏感型。
[0020]本发明提出了以所述嵌段聚合物用于制备对肿瘤细胞具有增强的细胞内药物控制释放特性的智能纳米胶束载体的用途。本发明利用肿瘤细胞中CB的过表达，利用对CB敏感的二肽和间隔化合物PABOH为连接键，合成了式(I I )mPEG-Va 1-Ci t-PABC-NH-Cn，进而构筑其载药胶束，研究胶束在模拟的溶酶体条件下的释药行为，评价其体外毒性。
[0021 ] 在一具体实施方案中，以mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18为例，说明CB敏感的嵌段聚合物及其制备方法和应用。
[0022](一)mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18嵌段聚合物的合成和表征
[0023](I )Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Ci8 的制备；
[0024](2)脱 Fmo c 保护的 Va 1-C i t-PABC-NH-Cis 的制备；
[0025](3)嵌段聚合物 mPEG-Va 1-C i t-PABC-NH_C18 的制备；
[0026](4)合成用于对照研究的不含PABOH的嵌段聚合物mPEG-Val-Cit-NH-C18。
[0027](二)嵌段共聚物纳米胶束系统的构筑及表征
[0028]用溶剂蒸发法制备mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18胶束及SN-38载药胶束，测定其临界胶束浓度;用透射电镜(TEM)观测其形貌，用动态光散射仪(DLS)测定粒径大小及分布;用芘荧光探针法测定其临界胶束浓度;用高效液相色谱测定载药胶束的包封率和载药量。
[0029](三)嵌段共聚物纳米胶束的降解及释药性能
[0030]用DLS追踪mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18纳米胶束在模拟的肿瘤细胞溶酶体环境中降解的粒径变化情况;测定载药胶束mPEG-Val-Cit-PABC-NH-CidPmPEG-Val-Cit-NH-C^a释药性能。
[0031 ](四)载SN-38的mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis和mPEG-Val-Cit-NH-Cis胶束的细胞毒性研究
[0032]噻唑蓝(MTT)比色法检测两种空白胶束mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis和mPEG-Val-Cit-NH-C18 对结肠癌细胞 HCT-116 的细胞毒性以及载 SN-38 的 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C^PmPEG-Val-Cit-NH-C18载药胶束及阳性药SN-38对结肠癌细胞HCT-116的细胞毒性。
[0033]本发明有益效果包括:本发明所述嵌段聚合物可以用于构筑纳米胶束，可以增强细胞内的药物控制释放，并且在引入PABOH间隔基后具有更好的释药性能和较低的细胞毒性。本发明所述嵌段聚合物包含亲水性的甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物和亲脂性的脂肪胺，并通过组织蛋白酶B可降解的二肽Val-Cit及PABOH将其偶联，从而制得一种两亲性的嵌段共聚物。本发明聚合物自组装形成的纳米载药胶束可实现增强的肿瘤细胞内的药物控制释放，细胞毒性较低，其具有作为疏水性抗肿瘤药物载体的广泛应用前景。
【附图说明】
[0034]图1 为嵌段共聚物 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis 和对照物 mPEG-Val-Cit-NH-Cis 的合成路线图。
[0035]图2为mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cid^^束的粒径分布((A)为DLS图)及形貌图((B)为TEM 图)ο
[0036]图3为mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18胶束在模拟的肿瘤细胞溶酶体环境下的粒径变化图。
[0037]图4 为载药的 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis 和 mPEG-Val-Cit-NH-Cis 胶束在模拟的肿瘤细胞溶酶体环境下的释药速率图。
[0038]图5 为载药的 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis 和 mPEG-Val-Cit-NH-Cis 胶束及 SN-38 对HCT-116细胞的细胞毒性图(A)为两种载药材料mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cl8和mPEG-Val-Cit-NH-C1MiHCT-1ie细胞的毒性，(B)为装载了SN-38的载药胶束对HCT-116细胞的细胞毒性。
【具体实施方式】
[0039]结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0040] 实施例1
[0041 ] Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn 的制备，η为 18
[0042 ]将Fmoc-Va 1-Ci t-PABC-PNP (11 Omg，0.14mmo I)、硬脂胺(46mg，I.2equ i v)和DMAP(21mg，1.2eqUiv)的混合物溶于20mL二氯甲烷中，氮气保护下于室温搅拌36小时后，浓缩反应液后加入30mL乙醚超声，过滤、干燥得到固体产物98mg，产率为76%。
[0043]实施例2
[0044]脱Fmoc 保护的 Val-Cit-PABC-NH-Cn 的制备，η为 182
[0045]将Fmoc-Va1-Cit-PABC-NH-Cis (245mg，0.27mmo I)溶于 15mL二甲基