糖化方法
【专利说明】糖化方法
[00011 本发明申请是基于申请日为2007年12月12日，申请号为200780101920.0(国际申 请号为PCT/US2007/087209)、名称为"糖化方法"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 对序列表的引用
[0003] 本发明包含计算机可读形式的序列表。通过引用将计算机可读形式并入本文。 发明领域
[0004] 本发明涉及用于生产啤酒用麦芽汁和用于产生啤酒的改进的糖化方法。
[0005] 发明背景
[0006] 在现代的糖化方法中，当酶中的糖化麦芽量较低或允许使用所有辅助谷物 (adjunct grist)时，经常将酶作为补充剂而加入。也在用高含量酶进行充分修饰的麦芽的 糖化中使用酶，以增加提取回收率以及可发酵糖的量。因此公知应用脱支酶，例如，异淀粉 酶或支链淀粉酶，以增加可发酵糖的得率。可以在用于产生低热量啤酒的方法中应用脱支 酶。这种方法为Wi 1 low等(MBAA Technical Quarterly，1977，14:105)、美国专利No · 4，528， 198、4,666,718和4,318,927和68 2056484和68 2069527的主题。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明的发明人现在令人惊讶地发现，通过使用某种支链淀粉酶，可以使用更少 量的酶蛋白而实现糖化。
[0009] 因此，在第一方面，本发明提供用于产生啤酒用麦芽汁的方法，其中包括由谷物形 成醪，并将所述醪与支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41)接触，其中所述支链淀粉酶具有氨基酸，所 述氨基酸序列a)与SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列至少50%相同，或b)由在低严紧条件下 与下述杂交的核酸序列编码：i)编码SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的核酸序列的互补链， 或i i) (i)的至少100个核苷酸的亚序列。
[0010]在第二方面，本发明提供根据由第一方面的方法产生的麦芽汁。
[0011] 在第三方面，本发明提供由第一方面的方法产生的浓缩的和/或干燥的麦芽汁。
[0012] 在第四方面，本发明提供由第二和第三方面的麦芽汁产生的啤酒。
[0013] 在第五方面，本发明提供适用于第一方面的方法中的组合物，所述组合物包括支 链淀粉酶(E. C. 3.2.1.41 )、葡糖淀粉酶和可选的α-淀粉酶，其中支链淀粉酶具有氨基酸序 列，所述氨基酸序列a)与SEQ ID Ν0:4中所示的氨基酸序列至少50%相同，或b)由在低严紧 条件下与下述杂交的核酸序列编码：i)编码SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的核酸序列的 互补链，或ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列。
[0014]具体地，本发明涉及如下各项：
[0015] 1.用于产生啤酒用麦芽汁(Brewer's wort)的方法，其中包括从谷物形成醪，和将 所述醪与支链淀粉酶接触，其中所述支链淀粉酶具有下述氨基酸序列：
[0016] a)与SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列至少86%相同；或
[0017] b)由核酸序列编码，所述核酸序列在低严紧条件下与下述杂交：
[0018] i)编码SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的核酸序列的互补链;或
[0019] ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列。
[0020] 2.根据项1的方法，其中所述支链淀粉酶源自嗜酸普鲁兰芽孢杆菌（Bacillus acidopullulyticus)〇
[0021 ] 3.根据项1或2的方法，其进一步包括将所述醪与葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶接触。
[0022] 4.根据前述项中任一项的方法，其中葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶源自黑曲霉 (Aspergillus niger)或埃默森踝节菌（Talaromyces emersonii)。
[0023] 5.根据前述项中任一项的方法，其进一步包括将所述醪与选自下组的酶接触:纤 维素酶、异淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶。
[0024] 6.根据前述项中任一项的方法，其中所述谷物包括发芽和/或未发芽的谷粒。
[0025] 7.根据前述项中任一项的方法，其中未发芽的谷粒和/或发芽的谷粒选自下列：大 麦、小麦、黑麦、高粱、黍、玉米和稻。
[0026] 8 .根据前述项中任一项的方法，其中发芽的谷粒包括选自发芽的大麦、小麦、黑 麦、高粱、黍、玉米和稻的发芽谷粒。
[0027] 9.根据前述项中任一项的方法，其中所述麦芽汁是浓缩的和/或干燥的。
[0028] 10.根据前述项中任一项的方法，其还包括发酵麦芽汁以获得酒精饮料。
[0029] 11.根据项10的方法，其中所述酒精饮料是啤酒。
[0030] 12.根据项11的方法，其中所述啤酒是爱儿啤酒、烈性爱儿啤酒、苦味酒、烈性黑啤 酒、钵尔透黑啤酒、陈贮啤酒、出口型啤酒、麦芽酒、大麦酒、低麦芽啤酒、高醇啤酒、低醇啤 酒、低热量啤酒或清淡啤酒。
[0031] 13.由根据前述项中任一项的方法产生的麦芽汁。
[0032] 14.根据前述项中任一项的浓缩的和/或干燥的麦芽汁。
[0033] 15.由根据前述项中任一项的麦芽汁产生的啤酒。
[0034] 16.适用于根据前述项中任一项的方法中的组合物，所述组合物包括支链淀粉酶、 葡糖淀粉酶和任选的淀粉酶，其中所述支链淀粉酶具有如下的氨基酸序列，所述氨基酸 序列
[0035] a)与SEQ ID Ν0:4中所示氨基酸序列至少50%相同；或 [0036] b)由在低严紧条件下与下述杂交的核酸序列编码：
[0037] i)编码SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的核酸序列的互补链或 [0038] i i) (i)的至少100个核苷酸的亚序列。
[0039] 17.根据项16的组合物，其中葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶源自黑曲霉或埃默森踝节 菌。
[0040] 发明详述
[0041 ]酿造方法在本领域中公知，并且通常包括发麦芽(malting)、糖化(mashing)和发 酵的步骤。糖化是将来自碎大麦麦芽和固体辅料的淀粉转化成可发酵和不可发酵的糖，从 而产生具有理想组成的麦芽汁的方法。传统的糖化包括将碎大麦麦芽和辅料与水在设定温 度和以设定体积混合，以使在发麦芽工艺中开始的生物化学变化继续进行。糖化方法在各 种温度进行一段时期，以活化负责降解蛋白质和糖的内源酶。至今为止，糖化中带来的最重 要的变化是将淀粉分子转化成可发酵糖。在传统的糖化方法中负责淀粉转化的主要的酶是 和β_淀粉酶。α-淀粉酶通过将淀粉分子分解成很多可受到β-淀粉酶攻击的更短的链而非 常快速地还原不可溶和可溶的淀粉。产生的二糖是麦芽糖。除了在糖化过程中形成的麦芽 糖之外，还产生短的支链葡萄糖寡聚物。短的支链葡萄糖寡聚物是不可发酵的糖，能够使成 品啤酒味道更好，并增加热量。
[0042] 在糖化后，当所有淀粉都已经分解时，需要从固体(酒糟）分离液体提取物（麦芽 汁）。麦芽汁的分离和过滤很重要，因为固体包含大量的蛋白质，基本未修饰的（poorly modified)淀粉，含脂肪材料，硅酸盐和多酚(丹宁）。在从酒糟分离麦芽汁后，可以用酿造酵 母发酵酒糟以产生啤酒。
[0043] 关于常规酿造方法的详细信息可以在Research and Teaching Institute of Brewing,Berlin(VLB)的Wolfgang Kunze的〃Technology Brewing and Malting"，1999年 第二版修订版，ISBN 3-921690-39-0中找到。
[0044] 在糖化过程中形成的短的支链葡萄糖寡聚物可以通过加入外源酶(除了麦芽之外 加入的酶)而进一步水解。脱支酶如支链淀粉酶(pul lulanase)和异淀粉酶(isoamylase)水 解这些寡聚物中的支链α-1-6糖苷键，从而释放葡萄糖或麦芽糖和直链寡聚物，其受到内源 酶(源自麦芽)和/或外源酶，例如，α_淀粉酶，β_淀粉酶和葡糖淀粉酶的作用。
[0045] 本发明提供适于产生不可发酵糖含量低的麦芽汁的新方法。该方法使用特定选择 的支链淀粉酶活性。
[0046] 定义
[0047] 在本公开的内容中，使用了本领域普通技术人员通常理解的多个术语。但是，几个 术语使用了特定的含义，含义如下所限定。
[0048]如本文所使用的，将术语"谷物(grist)"理解为含有淀粉或糖的材料，其是啤酒生 产的基础，例如，大麦麦芽和辅料。通常，谷物不包含任何添加的水。
[0049]将术语"麦芽"理解为任何发芽的谷类谷粒(malted cereal grain)，特别是大麦。
[0050] 将术语"辅料"理解为谷物中不是大麦麦芽的部分。辅料可包括任何富含淀粉的植 物材料，如，未发芽的谷物，如大麦、稻、玉米、小麦、黑麦、高粱和易于发酵的糖和/或糖浆。
[0051] 将术语"醪(mash)"理解为包含淀粉的浆料，该浆料包含浸于水中的谷物。
[0052]将术语"麦芽汁"理解为糖化过程中提取谷物后的未发酵的液体流出物（liquor run-off)〇
[0053]将术语"酒糟"理解为提取谷物和分离麦芽汁后残余的沥干的(drained)固体。 [0054]将术语"啤酒"在本文中理解为发酵后的麦芽汁，即，从大麦麦芽，任选的辅料和啤 酒花酿造的含酒精饮料(alcoholic beverage)。
[0055]术语"同源序列"用于表征如下序列，其具有与已知序列至少70 %，优选至少75 %， 或者至少80%，或者至少85%，或90%，或至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少 99%或者甚至至少100%相同的氨基酸序列。用于同源性确定的氨基酸序列的相关部分是 成熟多肽，即，不含信号肽。术语"同源序列"也用于表征在低严紧性，中严紧性，中/高严紧 性，高严紧性，或甚至非常高严紧性与已知序列杂交的DNA序列。用于确定在低、中或高严紧 性核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间杂交的合适的实验条件包括:将包含DNA片段或RNA 的滤膜预浸以在5x SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等，1989)中杂交10分钟，并在5x SSC， 5x Denhardt溶液（Sambrook等，1989)，0.5%SDS和100微克/ml变性超声处理鲑精DNA的溶 液中将滤膜预杂交（Sambrook等，1989)，然后在包含浓度为10ng/ml的随机引发的 (Feinberg 和Vogel stein，1983，Anal · Biochem. 132:6-13)、用32P_dCTP 标记的（比活性〉 1 xl09cpm/微克)探针的相同溶液中在约45 °C杂交12小时。然后将滤膜在2x SSC，0.5 % SDS 中，在约55°C(低严紧性），更优选约60°C(中严紧性），更优选约65°C(中/高严紧性），甚至更