一株减毒猪霍乱沙门氏菌及其制备方法和应用

文档序号:9859028阅读:798来源:国知局
一株减毒猪霍乱沙门氏菌及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域,具体涉及一株减毒猪霍乱沙门氏菌及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 随着新老传染病的不断流行,研究和开发有效防治传染病的方法显得极为迫切。 在过去两百多年中,疫苗在防止细菌或病毒性传染病中发挥了巨大的作用。由于疫苗相对 于大多数药物而言,具有使用成本低的优势,因此,不断的研究和开发疫苗是十分必要的。
[0003] 在疫苗研究领域中,利用沙门氏菌作为载体已经得到了广泛的研究。然而,目前对 沙门氏菌,特别是某种沙门氏菌(如猪霍乱沙门氏菌)的毒力基因,尚未完全研究清楚。在过 去二十多年中,得到广泛认同的减毒沙门氏菌疫苗候选株为数不多,如营养缺陷型突变株 (aroA、aroCD、purA)、压力反应缺陷株(htrA)、腺苷酸环化酶缺陷株(cya、crp)等。
[0004]造成有效的减毒菌株开发数量少并困扰研究人员的主要问题之一是:在众多已发 现或可能的毒力基因中,并未得到哪些毒力基因一定适用于某类或某种减毒菌株的构建的 确切认识。因而,对于具体某种细菌的减毒构建而言,需要进行大量实验确定相关的毒力因 子,并寻求适用于该菌株的减毒构建方案。对于研究较少的细菌而言(如猪霍乱沙门氏菌), 减毒菌株的研究工作更显得十分困难。
[0005] 在减毒猪霍乱沙门氏菌载体构建的研究领域中,有效的菌株主要为galE突变株、 aroA突变株、cya/crp突变株、以及其它基于slyA、hilA等基因而构建的突变株。目前而言, 对于是否还可以采取其它方法对猪霍乱沙门氏菌进行减毒构建,尚未十分清楚。因此亟待 开发其它对猪霍乱沙门氏菌有效的减毒构建方法,以深化对减毒菌株构建乃至相关疫苗研 究的认识。

【发明内容】

[0006] 针对现有技术的缺点,本发明的目的之一在于提供一株减毒猪霍乱沙门氏菌 S.Cholerasuis S1209,其特征在于,所述减毒猪霍乱沙门氏菌S.Cholerasuis S1209缺失 wzx基因,分类命名为Salmonella choleraesuis S1209,保藏于武汉市武昌珞珈山的中国 典型培养物保藏中心(武汉大学)中国典型培养物保藏中心,保藏号为:CCTCC Μ 2015631, 保藏时间为:2015年10月22日。
[0007] 本发明的发明人经过大量的实验发现wzx基因与猪霍乱沙门氏菌的毒力具有较强 关系,通过敲除其wzx基因可以获得减毒效果好的减毒菌株。原因可能在于wxz基因构成沙 门氏菌〇抗原LPS结构的翻转酶,而LPS结构对于沙门菌的毒力具有重要作用。
[0008] 需要指出的是,目前对于哪些是猪霍乱沙门氏菌的主要毒力基因尚未建立确切的 理论指导,在其它沙门氏菌或者其它需要进行减毒设计的菌种中行之有效的减毒方案,对 于猪霍乱沙门氏菌而言并不奏效或效果较差。如本发明的一个实施例所示,当进行wzy基 因、wbaB基因、wbaC基因、manB基因、manC基因缺失处理时,所得处理后的猪霍乱沙门氏菌菌 株要么不具备减毒效果、要么减毒效果不理想。
[0009] 如本发明的实验例所示,本发明所得菌株具有非常良好的减毒效果。
[0010] 本发明对本领域的贡献之一在于,发现了 WZX基因与猪霍乱沙门氏菌毒力的关系, 并构建了一株减毒效果优秀的猪霍乱沙门氏菌。
[0011] 本发明的第二个目的在于提供制备上述减毒猪霍乱沙门氏菌S.Cholerasuis S1209的方法,该方法包括如下步骤:
[0012] 1)对wzx基因的上同源臂和下同源臂进行扩增;
[0013] 2)用猪霍乱沙门菌C3545基因组为模板,扩增wzx的下同源臂和下同源臂;
[0014] 3)融合片段构建:以wzx基因片段的上同源臂和下同源臂为模板,扩增同源臂融合 片段;
[0015] 4)用Ahdl酶切质粒PRE112,回收纯化酶切产物,用连接试剂盒连接PRE112大片段 与同源臂融合片段,连接产物经转化和质粒抽提后,得到质粒pRE112-A WZX;
[0016] 5)将质粒PRE112- Δ wzx转入C7232菌株感受态细胞,以含有质粒PRE112- Δ wzx的 c7213菌株为供体菌,以C3545菌株作为受体菌,进行结合转移,经PCR鉴定后,得到减毒猪霍 乱沙门氏菌3.〇1〇16瓜81118 31209;
[0017] 所述wzx基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示;
[0018]所述wzx基因片段的上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;
[0019] 所述wzx基因片段的下同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0020] 用于扩增wzx基因的上同源臂的引物为:
[0021] Dwzx-1F:CCGCTGATGGAAGTGCGAACG
[0022] Dwzx-1R:ggttaacttattttactttccggatgtaaac
[0023] 用于扩增wzx基因的下同源臂的引物为:
[0024] Dwzx~2F:gtaaaataagttaaccaagcgggaaaatatc
[0025] Dwz x-2R:GATTCAACAAACTCTTTCACCG。
[0026] 步骤1)中,对wzx基因的上同源臂进行扩增时,扩增片段大小为346bp;对wzx基因 的下同源臂进行扩增时,扩增片段大小为333bp。
[0027] 在步骤2)中进行扩增时,PCR反应体系为:于50yL反应体系中进行,具体反应体系 为模板DNA lyL,Takara高保真酶25yL,上、下游引物各lyL,ddH20 22yL;具体条件为:98°C 变性2min后进入循环,循环参数为98°(:108,55°(:158,721€30 8,共循环30次;循环后72°(:延 伸lOmin。
[0028] 在步骤3)中进行融合片段构建时,PCR反应体系为:于50yL反应体系中:上下游同 源臂DNA各lyL,Takara高保真酶25yL,ΙΟμπιο 1/L上、下游引物各lyL,ddH20 22yL;具体条件 为:98°C变性5min后进入循环,循环参数为98 °C 10s,55°C 15s,72°C 30s,共循环30次;循环后 72°C 延伸 10min。
[0029] 步骤5)所述结合转移步骤为:用含DAP的液体LB培养基培养供体菌,用LB培养基培 养受体菌,至OD600为0.6左右,取供体菌500ul,受体菌300ul于含氯霉素抗性(25yg/mL)平板 一侧混匀,平板斜放,正放培养24h,挑取菌苔,划线,37°C静止培养,直至得到单菌落,得到 的单菌落进行蔗糖负筛。所述蔗糖负筛的步骤为:挑取单菌落加入无 NaCl的LB液体培养基, 于37°C,70rpm下,摇菌2h,取100ul菌液10倍倍比稀释1000倍后,再取100ul菌液涂含10%蔗 糖的LB平板。
[0030] 步骤5)所述PCR鉴定,步骤为:
[0031]对长出单菌落的蔗糖平板,选择一个区域进行挑菌,每个菌落同时分别划线于Cm 板LB板,挑菌时沾到即可不要挑到菌落下方菌;
[0032]鉴定并存菌,在于挑取10~20个Cm不生长,LB生长的菌落,得到的阳性菌落再次划 线LB板后,PCR鉴定,仍为阳性者,为缺失株构建成功;
[0033] PCR反应体系:up水4.4ul、模板DNA 0.2ul、上同源臂上游引物0.2ul、下同源臂下 游引物〇.2ul、Pfu PCR Master(KP201)5ul;PCR反应条件:94°C预变性5min、94°C变性30s、 55°C退火30s、72°C延伸lmin、72°C延伸lOmin、变性至延伸步骤重复30个循环。
[0034]本发明的另一个目的在于提供上述减毒猪霍乱沙门氏菌S.Cholerasuis S1209在 疫苗上的应用。
[0035]本发明的有益效果:
[0036] 本发明发现了 wzx基因与猪霍乱沙门氏菌毒力之间的关系,所得菌株减毒效果好, 可用于疫苗的制备。
【附图说明】
[0037] 图1为对本发明菌株进行银染的结果图;其中第1泳道为野生菌,第3泳道为本发明 所得菌株。
【具体实施方式】
[0038] 下面通过实施例对本发明进行具体描述,有必要在此指出的是以下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整,仍属于本发明的保护范围。 [0039] 实施例1
[0040] 1、引物设计(用于突变株的构建与鉴定)
[0041] 参考猪霍乱沙门菌SC-67全基因组序列,设计2对引物分别用于缺失wzx基因 (Dwzx-lF/Dwzx-lR,Dwzx-2F/Dwzx_2R)。从猪霍乱沙门菌C3545中分别扩增wzx基因的上下 游片段:up-wzx(上同源臂)和down-wzx(下同源臂),扩增片段大小分别为346bp和333bp。
[0042] Dwzx-1F:CCGCTGATGGAAGTGCGAACG
[0043] Dwzx-1R:ggttaacttattttactttccggatgtaaac
[0044] Dwzx~2F:gtaaaataagttaaccaagcgggaaaatatc
[0045] Dwzx-2R:GATTCAACAAACTCTTTCACCG
[0046] 2、猪霍乱沙门菌C3545wzx突变株的构建
[0047] 用已提取的猪霍乱沙门菌C3545基因组为模板,分别用引物Dwzx-IF/Dwzx-IR, Dwzx_2F/Dwzx_2R扩增wzx基因的上下游同源臂。
[0048] PCR反应体系为:50yL反应体系中进行,具体反应体系为模板DNA lyL,25mmol/L MgCl2 0.5yL,buffer 10yL,10ymol/L上、下游引物各lyL,2mmol/L dNTPs lyL,DNA polymerase 0.75yL,ddH2〇 34.75yL。具体条件为:98°C变性5min后进入循环,循环参数为 94°C30s,55°C30s,72°Clmin,共循环30次。循环后72°C延伸lOmin。扩增的产物经1%的琼脂 糖凝胶电泳分析后,由DNA纯化回收试剂盒纯化PCR产物。
[0049] 3、重组自杀质粒的构建
[0050] 融合片段的构建:以纯化的wzX
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