高产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程及微生物发酵技术领域，具体涉及一种高产多糖絮凝剂的地 衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法。
【背景技术】
[0002] 微生物絮凝剂(Microbial flocculant，MBF)是微生物分泌的能够使悬浮液中的 固体颗粒、菌体、细胞和胶状物絮凝沉淀的大分子化合物，主要成分有多糖、糖蛋白、蛋白 质、纤维素和DNA等。微生物絮凝剂具有安全、高效、可生物降解和对环境无污染等优势，且 能产生絮凝剂的微生物种类多、生长快、易于采用工程手段而实现产业化，因此微生物絮凝 剂的开发前景十分看好。在过去的20多年中，研究人员陆续从土壤、淤泥、工业废水、船舶沉 积物和生物分泌物等来源中筛选得到许多能产多糖生物絮凝剂的细菌、霉菌、藻类和酵母 菌（Molecules,2011，16(3):2431-2442;Bioresource Technology，2013，137:226-232·)〇 目前，多糖生物絮凝剂已经应用于去除纺织印染废水中的色素 (Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2005,44(4) :179-186.),还可以去除工业废水中的重金属离子和其它悬 浮污染物（Bioresource Technology，2007,98(2): 361-367 ·) 〇
[0003] 然而絮凝剂产量低、成本较高，制约着它的大规模工业化应用。目前，对于培养基、 培养条件、生长因子等外部因素影响多糖絮凝剂合成的报道已经很多（Process Biochemistry,2014,49(4:576-582；Colloids and Surfaces B: Biointerfaces ,2014, 116:257-264)。选择廉价原材料、优化发酵过程或利用随机诱变进行菌种改进等方法对絮 凝剂产量的提高有效但效果非常有限，而且具有一定的盲目性。要实现生物代谢产物的有 效调控，必须定向施加必要的遗传变化来改进细胞的性能。
[0004] 而从微生物细胞的遗传及生理学角度对多糖絮凝剂合成影响的报道甚是少见。由 于多糖絮凝剂结构复杂，且大多数针对多糖的研究并不关注絮凝活性，所以有关多糖絮凝 剂代谢途径的研究还较少，而通过分子生物学技术改造菌株提高多糖絮凝剂产量的报道几 乎没有。因此通过基因工程技术构建高产优良菌株，进一步提高多糖絮凝剂活性及产量，具 有重要的经济价值及社会意义。
[0005] 本申请人在中国专利CN101503709中公开利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方 法，其中，微生物地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2876。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对现有技术中多糖絮凝剂絮凝活性不高，调控机理不明等问 题，提供一种高产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法，以及利用所述地 衣芽孢杆菌基因工程菌制备多糖絮凝剂的方法。
[0007] 本发明采用的微生物为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，该微生物已于 2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入 册编号为CGMCC如.2876(参见本申请人的在先专利0价01503709)。
[0008] 所述高产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301-1是在产胞外多糖的地衣 芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中过表达epsDEF基因的基因工程菌。
[0009] 所述epsDEF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No: 1所示。
[0010] 所述高产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌的制备方法如下：
[0011]将epsDEF基因克隆到表达载体上获得重组表达载体，将所得重组表达载体通过电 转化的方法导入到产胞外多糖的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中即获得高产 多糖絮凝剂的基因工程菌Bacillus licheniformis HN301-1。
[0012]所述多糖絮凝剂的制备方法如下：
[0013] 将高产多糖絮凝剂的基因工程菌Bacillus licheniformis HN301-1发酵培养，收 集发酵液，提纯，即得多糖絮凝剂。
[0014] 所述发酵培养的温度可为30~40°C，发酵培养的时间可为48~60h;发酵培养的温 度优选为35~40 °C，发酵培养的时间优选为50~60h;发酵培养的温度最好为37 °C，发酵培 养的时间最好为56h。
[0015] 所述提纯的方法可为：采用乙醇提取，离心速度为6000~SOOOrpm，离心时间为10 ~15min，离心温度为4°C;所述乙醇的用量按体积比可为发酵液的3倍。
[0016]本发明采用的表达载体为本实验室构建的表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL。所 述表达载体的启动子为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因的启动子。 [0017]本发明的重组表达载体的构建方法为:将所述epsDEF基因的核酸分子与表达载体 PHY300PLK-PamyL-TTamyL质粒分别用限制性内切酶Κρη I和Spe I双酶切，形成互补的粘性 末端，分别纯化后经T4DNA连接酶，形成本发明所述重组表达载体，将所得的重组表达载体 命名为PHY300-epsDEF。将所得重组表达载体通过电转化的方法导入到产胞外多糖的地衣 芽孢杆菌中获得高产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301 -1，利用所得高产多糖 絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301 -1发酵制备多糖絮凝剂。
[0018] 本发明所述epsDEF基因为糖基转移酶基因，所述epsDEF基因的核苷酸序列如序列 表中SEQ ID No: 1所示。该基因的制备方法为本领域常规的制备方法，为从地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)CGMCC 2876的基因组中分离获得，或者从含有该SEQ ID No: 1 所示的核苷酸序列的重组表达载体中获得，也可以全基因人工合成获得。
[0019] 本发明所述将重组表达载导入地衣芽孢杆菌的方法为本领域常规的技术方法，较 佳地为原生质体转化法或者电击转化法，更佳地为电击转化法。
[0020] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0021 ]其中所述从发酵液中制得多糖絮凝剂的方法为本领域常规的制备方法，所述制备 方法较佳地包括以下步骤:将所得发酵液离心收集上清液，将所得上清液用乙醇法沉淀，沉 淀溶解于水后冷冻真空干燥即得。
[0022] 本发明所述试剂和原料均市售可得。
[0023] 本发明的技术效果在于:本发明提供的地衣芽孢杆菌基因工程菌在发酵过程中发 酵液絮凝活性显著提高，多糖絮凝剂产量显著提高。所制得的多糖絮凝剂在污水处理和食 品工程的应用方面具有广阔的前景。
【附图说明】
[0024]图1为过表达重组载体构建方法示意图。
[0025]图2为重组载体的PCR验证结果图。
[0026]图3为重组载体的双酶切验证结果图。
[0027] 图4为地衣芽孢杆菌CGMCC 2876出发菌株生长曲线图。
[0028] 图5为过表达epsDEF基因工程菌生长曲线图。
【具体实施方式】
[0029]根据下述实施例，可以更好理解本发明。然而本领域的技术人员容易理解，实施例 所描述的内容仅限于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发 明。
[0030] 实施例1:重组表达载体PHY300-epsDEF的构建 [0031] 设计PCR引物，用于扩增espDEF基因片段。
[0032]上下游引物分别为：
[0033] 上游引物:GGGGTACCATGACAAGAACGGTTTTGT(下划线为Κρη頂每切位点）
[0034] 下游引物:GGACTAGTTCACTGTCCTTCTGCCGC(下划线为Spe頂每切位点）
[0035] 以Bacillus licheniformis CGMCC 2876基因组DNA为模板，进行如下PCR程序： (1)94°C，5min; (2)94°C，30s; (3)55°C，30s(4)72°C，lmin，（2)~（4)步重复35个循环；（5)72 °C，10min，4°C 保存。
[0036] PCR反应体系如表1所示。