一种改良的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的分离制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物、医药学等领域，具体涉及一种改良的、收缩型大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的高效制备方法。
【背景技术】
[0002]正常生理状态下的血管平滑肌细胞(VSMC)呈收缩表型，当细胞从收缩型向合成型转变后，其增殖加快、迀移变强、并向内膜层生长，使得血管管壁加厚、管腔变窄，血流阻力增高，导致高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生。VSMC如何维持其收缩型表型、病理状态下的异常表型如何发生和转变，这些机理问题的阐述不仅有助于我们了解心血管疾病发病机理，更是研发各类心血管疾病防治手段的基础。鉴于VSMC在心血管疾病研治中的特殊作用，如何高效、简便地制备活性好、纯度高的VSMC，成为目前首要任务。
[0003]目前，分离培养VSMC的方法主要有组织块贴壁法和酶消化法。前者以器械机械剥离外膜、刮除内膜、将血管剪成Imm2的小块置于培养瓶中进行贴壁培养。该方法对操作技巧要求高，剥离外膜时易有残留，刮除内膜时用力过小会有内皮细胞残留、用力过度则易刮伤中膜层。因此，初学者采用此方法进行VSMC分离时，经常有组织块漂浮、细胞培养时间过长的问题。酶消化法则是采用蛋白酶对剔除干净周围组织的血管进行直接消化来分离VSMC。先后有人采用胶原酶、胰酶单一消化或者二酶复合消化进行VSMC分离的成功报道，但是胶原酶消化时间过长6?12小时不等，而胰酶对VSMC有较强的损害，消化时间不易掌握，容易消化不均匀导致对平滑肌细胞损伤较大，不易得到活性好、数量多的平滑肌细胞。也有人联合酶消化法和组织块贴壁法，先机械剥离外膜再进行酶消化。但是仍然存在过度牵拉中膜层、过长的酶消化等损伤平滑肌细胞等问题。
[0004]为克服现有技术的不足之处，我们综合了国内外VSMC成功分离的经验，对酶消化法进行了有效的改良。采用复合酶“二步法”，先消化内外膜，避免了去除内外膜时对中膜层产生的机械拉伤;随后再消化中膜层以释放并分离VSMC。该改良方法操作简单、分离效果重复性好，获得的VSMC的数量和质量高、活力和纯度好，特别适用于VSMC分离的初学者。
【发明内容】
[0005]鉴于现有技术的以上不足，本发明提出一种改良的简便高效的收缩型大鼠胸主动脉VSMC的分离方法，使所获得的收缩型VSMC的纯度高、活力好，可在体外进行传代培养。
[0006]本发明目的的实现手段如下:一种收缩型大鼠胸主动脉VSMC的体外分离制备方法，通过二步复合酶消化释放大鼠胸主动脉VSMC和细胞悬液制备大鼠胸主动脉收缩型血管平滑肌细胞，包括如下步骤
[0007]I)取乙醚麻醉大鼠，迅速剪取其胸主动脉；
[0008]2)反复冲洗胸主动脉，去掉其表面粘附的凝血等组织块；
[0009]3)剔净血管的周围组织，然后放入复合酶液中、在37°C的气浴恒温振荡器里消化45分钟，随后剥离血管外膜层、刮除内膜层和剥离中膜层；
[0010]4)以含Ca2+、Mg2+的HBSS漂洗分离的中膜层，置于干净的培养皿进行快速剪碎(1-2mm3)，然后转入放有复合酶液的6孔板内、并于孵箱中37 °C、5 % CO2，消化I小时；
[0011]5)终止消化，用1ml的注射器抽打组织消化液直至细胞基本从组织残片中脱离，再用细胞筛过滤获得悬液;取滤网上的组织，重复抽打和过滤，将多次过滤后的细胞悬液一起转移到15ml的离心管里，1000转/分、离心5分钟收集细胞；
[0012]6)取含20%FBS的DMEM悬浮细胞，种入6孔板进行培养。
[0013]在实施过程中，其中所述步骤I)中的胸主动脉为新鲜采集的活体胸主动脉，取出后置于1-4 °C的容器中。
[0014]其中所述步骤2)中的清洗液为高压灭菌的PBS或者高压灭菌的生理盐水，器具为2ml的注射器。
[0015]其中所述步骤3)中的复合酶配方为二型胶原酶lmg，胰蛋白酶抑制剂lmg，胰肽酶7.08μ1，最后用含Ca2+、Mg2+的HBSS定容为lml。平均一段大鼠胸主动脉需Iml复合酶。
[0016]其中所述步骤3)中消化时间为45-50分钟，随胸主动脉的大小和酶液活性变化略加变动。当消化过程中观察到血管变透明、周围组织成絮状可终止消化。
[0017]其中所述步骤3)中剥离外膜和刮除内膜均在预冷的不含血清的带双抗的DMEM中进行。
[0018]其中所述步骤4)中的复合酶的配制和使用量同步骤3)。
[0019]其中所述步骤4)中消化在细胞培养箱中进行，时间为I小时左右，每20分钟取出轻微晃动。消化50分钟后一般可观察到有大量细胞在组织块表面呈葡萄状暴露并开始游离出来。这时终止消化。
[0020]其中所述步骤5)中终止消化用含20 %FBSa% P/S的DMEM培养基。
[0021 ] 其中所述步骤5)中细胞筛孔径为40μπι。
[0022]其中所述步骤6)中细胞种植密度为I条主动脉/I个孔(6孔板)，在37°(:、5%0)2培养箱内培养。
[0023]依本发明所分离培养的大鼠胸主动脉VSMC在镜下观察呈梭形、长条形和三角形，纯度超过95 %。
[0024]比较本发明提供的大鼠胸主动脉VSMC分离培养方法与传统的组织块贴壁法，可发现由于去除外膜的操作温和简便，避免了机械除膜时对中膜层的平滑肌细胞的刮伤，且避免了外膜残留、降低了其污染。与传统的单一酶消化法相比，本发明可显著缩短消化时间，便于保持细胞活性。而且本方法消化时间较稳定、消化较为均匀有效，确保细胞产量。和传统的复合酶消化法相比，本发明提供的复合酶的配制和使用操作不仅消化效果较好，而且步骤简捷、污染少。因此，本发明成功地摸索出一种操作简便、高效、重复性好的VSMC分离培养方法，可获得纯度好、活性佳、具有显著收缩型性状的VSMC。
【附图说明】
[0025]图1为大鼠胸主动脉VSMC的分离和培养结果图。其中，A为酶消化接近完成时细胞开始在组织块表面裸露出来时的形态;B为所分离的VSMC刚接种在6孔板中的形态;C为接种的VSMC静置48小时后开始贴壁的形态;D为第八天VSMC细胞呈峰谷状的生长形态。
[0026]图2为以CCK-8检测分离的VSMC在体外培养中的增殖结果图。
[0027]图3为所分离的VSMC细胞中各收缩型VSMC的表型基因mRNA表达水平的分析结果图。其中，A图为定量PCR分析的结果图，B为扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上的电泳结果图。
[0028]图4为所分离的VSMC细胞中收缩型VSMC的各表型蛋白表达水平的分析结果图。
[0029]图5为基因对应的特异引物序列表。
【具体实施方式】
[0030]为了使发明的目的、技术方案和优点更加清晰，下面结合附图对本发明作进一步的描述。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
[0031]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中化学试剂除特别说明外，均为市售。
[0032]实施例1原代大鼠胸主动脉VSMC的分离试验:
[0033]复合酶液配方:二型胶原酶lmg/ml(Worthington B1chemical Corporat1n,44N15309A,USA)，膜蛋白酶抑制剂lmg/ml (Worthington B1chemical Corporat1n,R4H15000 ,USA)，膜肽酶7.08yl/ml(Worthington B1chemical Corporat1n, 35M16094,USA)，以含Ca2+、Mg2+的HBSS为溶剂，定容为Iml;每条大鼠胸主动脉平均每次取Iml复合酶进行消化。
[0034]本实施例所用大鼠胸主动脉为体重90-120g、健康的SPF级别的SD大鼠。取乙醚进行动物麻醉，转至无菌手术台，将动物腹腔向上固定。先用75%的酒精喷湿大鼠胸腹部位置，依次剖开腹部、胸腔，取棉签拨开内脏，暴露出胸主动脉血管;再以眼科剪小心剔除粘附在血管外表面上的组织和粘膜，然后迅速剪取胸主动脉，置于高压灭菌、预冷的0.9%氯化钠生理盐水中，立即转移到超净工作台进行后续操作。
[0035]随后在操净台内，先用高压灭菌、预冷的生理盐水反复冲洗血管表面的血污;再用2ml的注射器吸取生理盐水进一步冲洗管腔内的凝血块等，直至没有血色物质被冲洗出来(3次左右)；然后小心剔净血管表面黏附的纤维组织，注意不要伤害血管，准备进行第一次酶消化。
[0036]分装出1ml 37°C预温的酶液，置于4ml的微量离心管(EP)管里。将上述处理干净的血管在HBSS液中略微漂洗，放入复合酶液中，在37°C的气预恒温振荡器里进行消化45分钟，摇速60转/分。该步消化结束后可见动脉血管趋透明、表面粘附组织呈絮状。小心取出消化后的血管，放在预冷的带双抗的DMEM中，使用弯头、直头眼科镊将整个外膜类似袜子一般剥离。漂洗余下的血管，用弯头的小剪刀沿纵向剪开血管；以弯头小镊轻轻刮除内膜2-4次，最后以含Ca2+、Mg2+的HBSS漂洗剥离的中膜。
[0037]将剥离的中膜置于干净的培养皿，以弯头眼科剪快速剪成l-2mm3小块，转入一个放有Iml复合酶液的6孔板，迅速转移到孵箱中，37°C，5 %C02，消化I小时；消化时每20分钟轻轻晃动孔板;消化50分钟以后开始借助显微镜观察细胞从组织块游离的情形。可以观察到组织块表面上细胞逐渐呈葡萄状显出，在边缘部分的细胞开始脱离组织纤维束缚、呈窜珠状游离，少量细胞已经完全游离于消化液中。
[0038]待多数组织块中的细胞开始脱落时，加入预热过的含20%血