一种用于培养间充质干细胞的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于干细胞培养领域，具体涉及一种用于培养间充质干细胞的试剂盒。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
[0003]间充质干细胞包括脐带间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。
[0004]脐带间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，具有来源广泛、易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议等诸多优点。流式细胞仪分析发现脐带间充质干细胞高表达间质细胞标志(⑶44、CD105)、整合素受体(⑶29、CD49b、⑶49c、⑶51)、不表达造血系标志(⑶34、CD45)白细胞抗原HLA-DR和内皮细胞标志CD31。脐带间充质干细胞在体内外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞以及神经元细胞等。目前人脐带间充质干细胞在组织工程骨、人工血管以及基因治疗等临床应用研究中已逐渐深入，并已显示出广阔的应用前景。目前，对脐带间充质干细胞的分离培养、扩增还没有统一的标准，存在纯度低、原代培养时间长等缺点。各种类型的成纤维成体干细胞扩增一般在2?3天开始进入指数式生长，相差不大，而原代细胞由于组织来源不同，出现细胞克隆时间差异较大，所以，原代细胞传代时间是分离得到目的细胞的关键。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种能够提高间充质干细胞原代细胞传代时间的培养试剂盒，以使间充质干细胞多次传代后依然保持有细胞全能性。
[0006]本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的:
[0007]—种用于培养间充质干细胞的试剂盒，包括细胞培养液A和细胞培养液B;
[0008]所述细胞培养液A为含80?120ng/ml细胞因子LIF、80?120ng/ml细胞因子bFGF和20?30yg/ml Salpichrolide O的Knockout-DMEM培养基；
[0009]所述细胞培养液B为胎牛血清。
[0010]进一步地，所述细胞培养液A为含100ng/ml细胞因子LIF、100ng/ml细胞因子bFGF和25yg/ml Salpichrolide O的Knockout-DMEM培养基。
[0011]进一步地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
[0012]进一步地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
[0013]进一步地，所述细胞培养液A和细胞培养液B均为无菌，并各自独立包装。
[0014]进一步地，所述的用于培养间充质干细胞的试剂盒还包括细胞洗涤液和细胞消化液;所述细胞洗涤液为生理盐水;所述细胞消化液为Collagenase II水溶液。
[0015]进一步地，所述细胞消化液为浓度为0.2g/100ml的Collagenase II水溶液。
[0016]进一步地，所述生理盐水由氯化钠和水组成，氯化钠的浓度为0.9g/100ml。
[0017]进一步地，所述细胞培养液A、细胞培养液B、细胞洗涤液和细胞消化液均为无菌，并各自独立包装。
[0018]上述试剂盒在间充质干细胞培养中的应用。
[0019]本发明的优点:
[0020]本发明提供的培养试剂盒能够提高间充质干细胞原代细胞传代时间，使间充质干细胞多次传代后依然保持有细胞全能性。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0022]本发明化合物Salpichrol ide O的制备方法参见文献:Withanol ides withPhytotoxicActivity from Two Species ofthe Genus Salpichroa:S.0riganifolia andS.tristis var.Lehmannii,J.Nat.Prod.2013,76,2219-22250
[0023]实施例1:试剂盒的制备
[0024]1、组分的制备
[0025]细胞洗涤液的制备:将9gNaCl溶于去离子水并用去离子水定容至1000ml，高压灭囷后置于4 C冰箱内备用。
[0026]细胞培养液A的制备:将细胞因子LIF、细胞因子bFGF和化合物Salpichrolide O溶于无菌Knockout-DMEM培养基(液体)，细胞因子LIF的浓度为100ng/ml，细胞因子bFGF的浓度为100ng/ml，化合物Salpichrolide O的浓度为25yg/ml。置于4°C冰箱内备用。
[0027]细胞培养液B为无菌胎牛血清，置于-20V冰箱内备用。
[0028]细胞消化液:将Collagenase II溶于去离子水使CollagenaseII的浓度为0.2g/100ml，置于4°C冰箱内备用。
[0029]2、组分的分装以及试剂盒的制备
[0030]用于分离脐带间充质干细胞的试剂盒(I次/盒)由独立包装的如下组分组成:I瓶细胞洗涤液(10ml/瓶)、I瓶细胞培养液A(80ml/瓶)，I瓶细胞培养液B(20ml/瓶)和I瓶细胞消化液(10ml/瓶)。
[0031]实施例2:试剂盒的制备，与实施例1对比，仅细胞培养液A中不添加SalpichrolideO
[0032]1、组分的制备
[0033]细胞洗涤液的制备:将9gNaCl溶于去离子水并用去离子水定容至1000ml，高压灭囷后置于4 C冰箱内备用。
[0034]细胞培养液A的制备:将细胞因子LIF和细胞因子bFGF溶于无菌Knockout-DMEM培养基(液体)，细胞因子LIF的浓度为100ng/ml，细胞因子bFGF的浓度为100ng/ml。置于4°C冰箱内备用。
[0035]细胞培养液B为无菌胎牛血清，置于-20V冰箱内备用。
[0036]细胞消化液:将Collagenase II溶于去离子水使Collagenase II的浓度为0.2g/100ml，置于4°C冰箱内备用。
[0037]2、组分的分装以及试剂盒的制备
[0038]用于分离脐带间充质干细胞的试剂盒(I次/盒)由独立包装的如下组分组成:I瓶细胞洗涤液(10ml/瓶)、I瓶细胞培养液A(80ml/瓶)，I瓶细胞培养液B(20ml/瓶)和I瓶细胞消化液(10ml/瓶)。
[0039]实施例3:脐带间充质干细胞的分离与快速扩增培养
[0040]分别用实施例1(实验组