一种鸡脑乙酰胆碱酯酶的双水相萃取方法及其对氨基甲酸酯类农药的敏感性检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及氨基甲酸酯类农药残留的检测领域，具体涉及一种鸡脑乙酰胆碱酯酶 的双水相萃取方法及其对氨基甲酸酯类农药的敏感性检测方法。
【背景技术】
[0002] 自从高度有机氯农药被禁止使用，氨基甲酸酯类农药是目前我国使用最主要的农 药之一。近年来，农药的大量使用引发的中毒事件频繁发生，引起各国政府和公众的广泛关 注。我国于2014年3月发布的国家标准《食品中农药最大残留限量》中重新明确规定了各种 氨基甲酸酯类农药的残留限量。由此可见氨基甲酸酯类有毒成分的分析检测尤为重要。
[0003] 现在酶抑制法作为氨基甲酸酯类有毒成分残留的主要测定方法，具有简便、快捷 及成本低廉等优点。检测用酶是酶抑制法的核心和关键，当前商品酶主要是从家蝇等敏感 昆虫头部提取，产量低、成本高，难以满足检测的需求。因此进行来源丰富、低成本、短时间 的新酶源的开发研究十分必要。鸡脑是鸡加工处理过程中的下脚料，来源丰富，但目前鸡脑 乙酰胆碱酯酶的研究较少。实验表明，鸡脑乙酰胆碱酯酶酶活高，用鸡脑作为酶源进行乙酰 胆碱酯酶的提取，也是对废弃物的高值化利用。
[0004] 传统提取方法多为柱层析提取，耗时长，工艺复杂，成本高。本发明所用的双水相 萃取广泛应用在蛋白、酶、多糖等物质的提取上，成本低、耗时短，是一种绿色的提取方法， 但尚未发现应用在鸡脑乙酰胆碱酯酶的提取上。
[0005] 本发明用双水相萃取鸡脑乙酰胆碱酯酶，所得酶制品活性高，对氨基甲酸酯类农 药具有高度的敏感性，对氨基甲酸酯类农药残留的检测具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种鸡脑乙酰胆碱酯酶的双水相萃取方法及其对氨基甲酸酯类农 药的敏感性检测方法。
[0007] 本发明的目的通过以下技术方案实现： 一种鸡脑乙酰胆碱酯酶的双水相萃取方法，该方法包括以下步骤： 1) 将新鲜的用生理盐水冲洗干净的鸡脑组织与含TritonX-100的磷酸盐缓冲液按质 量/体积比1:2~1:6混合，均质后静置10~30min，离心机6000~10000r/min，0~4°C离心10 ~30min，取上清液，用水稀释2~8倍后即得乙酰胆碱酯酶粗酶液；所述磷酸盐缓冲液中 TritonX-100的质量分数为0~1 · 0%; 2) PEG-1000/(NH4)2S〇4双水相体系:体系总质量为5~15g，其中PEG-1000的质量占体系 总质量的10~20%，（NH 4)2S〇4的质量占体系总质量的10~20%，体系pH为5~7,乙酰胆碱酯酶 粗酶液加入量为体系总质量的10~20%，其余成分为水，以此建立双水相体系，搅拌5~ 15min后，静置分相，以蒸馏水代替上清液加入体系中作为空白组，收集乙酰胆碱酯酶所富 集的上相作为实验组及相应的空白组上相； 3) PEG-1000/K2HP〇4反萃取体系:体系总质量为8~10g，将收集的实验组及空白组上相 调节pH为3~7，按照2:1~6:1的体积比例加入质量体积比为30~50%K 2HP〇4盐溶液，搅拌均 匀后，静置分相，形成新的双水相体系，记录上下相体积，收集下相； 4) 将收集的下相用磷酸盐缓冲液进行透析，将透析袋内的溶液进行真空冷冻干燥，即 得鸡脑乙酰胆碱酯酶的酶粉，配制成酶液后测定比活力。
[0008] 进一步地，步骤3)所述的K2HP〇4盐溶液是通过用质量体积比为30~50%的KH 2P〇4溶 液调节质量体积比为30~50%的1(2冊〇4溶液的pH至3~7所得。
[0009] 进一步地，步骤4)所述的用磷酸盐缓冲液进行透析，其中磷酸盐缓冲液浓度为 0.05~1111〇1/14!1为7~9，透析时间为8~2411。
[0010] -种鸡脑乙酰胆碱酯酶对氨基甲酸酯类农药的敏感性检测方法，具体的步骤如 下： 1) 半抑制浓度IC5Q的测定:取氨基甲酸酯类农药稀释液加入到磷酸盐缓冲液中，配置 成不同的浓度梯度〇、〇 · 004~0 · 006、0 · 009~0 · 011、0 · 09~0 · 11、0 · 4~0 · 6、0 · 9~1 · lyg/mL，得氨 基甲酸酯类农药溶液，在各浓度的氨基甲酸酯类农药溶液中分别取两组1~10mL于试管中， 然后向其中一组各浓度的氨基甲酸酯类农药溶液中分别加入鸡脑乙酰胆碱酯酶酶液0.05 ~lmL，再向余下一组各浓度的氨基甲酸酯类农药溶液中分别加入商品乙酰胆碱酯酶酶液 0.05~lmL，其中一管以蒸馏水代替酶液作为空白对照，混勾后于30~40°C水浴保温5~ 20min，加入DTNB溶液（5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）溶液)和4了011各0.05~11^，混匀后 立即在400~500nm处测定酶活，并计算抑制率，以农药浓度的对数lgC对抑制率1(%)作图， 求出乙酰胆碱酯酶的IC 50; 2) 双分子速率常数1的测定:分别取两份0.05~lmL鸡脑乙酰胆碱酯酶酶液于试管A、B 中，再分别取两份〇 . 05~lmL商品乙酰胆碱酯酶酶液于试管C、D中，然后在试管A、C中加入1 ~10mL0.05~lyg · ml/1氨基甲酸酯类农药稀释液，在试管B、D中加入蒸馏水代替农药作为 空白对照，测定四支试管在不同反应时间后的酶活，根据公式分别计算三支试管的L，取平 均值，
式中，Ki为双分子速率常数;Ei为不加农药的酶活;E2为加农药的酶活;Μ为农药的浓度， 转化为摩尔浓度;t为反应时间。
[0011] 进一步地，用于提取乙酰胆碱酯酶的原料采用鸡脑，所述的商品乙酰胆碱酯酶酶 液是市售的商品酶，来源于家蝇头部。
[0012] 进一步地，所述的氨基甲酸酯类农药为呋喃丹、灭多威、西维因、速灭威或涕灭威。
[0013] 进一步地，所述的鸡脑乙酰胆碱酯酶酶液和商品乙酰胆碱酯酶酶液为5~15mg/ mL，溶解于磷酸盐缓冲液中，所述的DTNB溶液和ATCHI的浓度为5~15mg/mL。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有以下优点： 1、本发明所用酶源是鸡肉加工过程中的废弃器官-鸡脑组织，原料丰富，价格便宜，而 且所用方法是一种绿色的提取方法，耗时短、操作简便，成本低，解决了传统方法耗时长、工 艺复杂的缺点。
[0015] 2、本发明所得乙酰胆碱酯酶制品，呈粉末状，易于储存，且经过与商品酶的比较， 鸡脑乙酰胆碱酯酶不仅酶活较高，而且对氨基甲酸酯类农药敏感性也高于商品酶。
【附图说明】
[0016] 图1为实施例4中以呋喃丹浓度的对数lgC对抑制率1(%)所作图，由图1求得IC5〇值。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例对本发明进一步详细说明。
[0018] 实施例1 (1) 将新鲜的用生理盐水冲洗干净的鸡脑组织l〇g与不含TritonX-100 (聚乙二醇辛基 苯基醚)的磷酸盐缓冲液20mL混合，均质后静置5min，离心机6000r/min，0°C离心10min，取 其上清液，用蒸馏水稀释2倍后即得乙酰胆碱酯酶粗酶液； (2) PEG-1000/(NH4)2S〇4双水相体系:体系总质量为5g，其中PEG-1000质量占体系总质 量的10%，（NH4) 2SO4质量占体系总质量的10%，体系pH为5，粗酶液质量占体系总质量的10%， 其余成分为水，以此建立双水相体系，搅拌5min后，静置分相，以蒸馏水代替上清液加入体 系中作为空白组，收集乙酰胆碱酯酶所富集的上相作为实验组及相应的空白组上相。
[0019] (3)PEG-1000/K2HP〇4反萃取体系:体系总质量为8g，将收集的实验组及空白组上相 调节pH为3,按照2:1的体积比例加入30%(m/v)K 2HP〇4盐溶液（用30%(m/v)的KH2P〇4溶液调节 30%(m/VM^K 2HP〇4溶液的pH至3)，搅拌均匀后，静置分相，形成新的双水相体系。记录上下相 体积，收集下相。
[0020] (4)将收集的下相用0.1mol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲液进行透析8h，将透析袋内的 溶液进行真空冷冻干燥，即得酶粉，将酶粉溶解于0.1mol/L，pH8.0的磷酸盐缓冲液中，比活 力为1.07U/mg。
[0021] 实施例2 (1) 将新鲜的用生理盐水冲洗干净的鸡脑组织l〇g与含0.5%(质量)TritonX-100 (聚乙 二醇辛基苯基醚）的磷酸盐缓冲液40mL混合，均质后静置lOmin，离心机8000r/min，4°C离 心20min，取其上清液，用蒸馏水稀释5倍后即得乙酰胆碱酯酶粗酶液； (2) PEG-1000/(NH4)2S〇4双水相体系:体系总质量为10g，其中PEG-1000质量占体系总质 量的15%，（NH4) 2SO4质量占体系总质量的15%，体系pH为6，粗酶液质量占体系总质量的15%， 其余成分为水，以此建立双水相体系，搅拌lOmin后，静置分相，以蒸馏水代替上清液加入体 系中作为空白组，收集乙酰胆碱酯酶所富集的上相作为实验组及相应的空白组上相。
[0022] (3)PEG-1000/K2HP〇4反萃取体系:体系总质量为9g，将收集的实验组及空白组上相 调节pH为5，按照4:1的体积比例加入40%(m/v)K2HP〇4盐溶液（用40%(m/v)的KH2P〇4溶液调节 40%(m/VM^K2HP〇4溶液的pH至5)，搅拌均匀后，静置分相，形成新的双水相体系。记录上下相 体积，收集下相。
[0023] (4)将收集的下相用0.1mol/L，pH8.0的磷酸盐缓冲液进行透析16h，将透析袋内的 溶液进行真空冷冻干燥，即得酶粉，将酶粉溶解于0.1mol/L，pH8.0的磷酸盐缓冲液中，比活 力为4.50U/mg。
[0024] 实施例3 (1) 将新鲜的用生理盐水冲洗干净的鸡脑组织log与含1.0%(质量)TritonX-100 (聚乙 二醇辛基苯基醚)的磷酸盐缓冲液60mL混合，均质后静置15min，离心机10000r/min，4°C离 心30min，取其上清液，用蒸馏水稀释8倍后即得乙酰胆碱酯酶粗酶液； (2) PEG-1000/(NH4)2S〇4双水相体系:体系总质量为15g，其中PEG-1000质量占体系总质 量的20%，（NH4) 2SO4质量占体系总质量的20%，体系pH为7，粗酶液质量占体系总质量的20%， 其余成分为水，以此建立双水相体系，搅拌15min后，静置分相，以蒸馏水代替上清液加入体 系中作为空白组，收集乙酰胆碱酯酶所富集的上相作为实验组及相应的空白组上相。
[0025] (3)PEG-1000/K2HP〇4反萃取体系：体系总质