一种液体深层发酵法生产桦褐孔菌木质纤维素降解酶的工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及发酵工程技术领域，特别涉及一种液体深层发酵法生产桦褐孔菌木质纤维素降解酶的工艺。
【背景技术】
[0002]木质纤维素是植物通过光合作用产生的主要生物质，它占总生物产量的60%以上。是自然界中含量最多的可用于食品、能源、医药的有机可再生资源。木质纤维素大量存在于各种农作物废弃物、纸肩、木肩和果壳中，是一种价格低廉可循环利用、来源丰富的资源。有效的利用这些资源是将碳转化为能源、食物和其他化学品的良好方式。
[0003]木质纤维素是生物圈最为丰富的天然高分子化合物，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。纤维素是由13-1O4个β-D-吡喃型葡萄糖单体通过β_1，4糖苷键联接而成的链状高分子聚合物。半纤维素是由高度分枝的杂多糖链组成，以木聚糖和葡聚糖为主。木质素是由多个苯丙烷单体组成的高分子芳香族类聚合物，它们相互之间通过C-O-C键和C-C键连接而成，苯丙烷单体的结构和连接键非常复杂，这使得木质素结构不容易被破坏，木质素在纤维素的降解中起到天然的屏障作用。木质素和半纤维素通过共价键的形式连接，而纤维素被木质素和半纤维素屏蔽在里面，因此，要想利用纤维素必须先破坏木质素，也就是预处理。对木质纤维素进行预处理必须满足以下要求:去除或改变木质素，降低纤维素结晶度，增加纤维素的可及表面积，提高纤维素的利用率;促进糖的形成，避免糖降解或损失；降低能量需求和成本投入。
[0004]在木质纤维素原料预处理中，对木腐菌木质纤维素降解酶的研究是目前国际热点。木腐菌包含三大类即软腐菌、褐腐菌、白腐菌，褐腐菌主要攻击对象是纤维素，而白腐菌和软腐菌攻击纤维素和木质素。白腐菌(white rot fungi)是指着生在木材上，菌丝穿入木质，侵入木质细胞腔内，能释放降解木质素和其他木质组分的酶，以降解木材中的木质素、纤维素、半纤维素，引起木质白色腐烂的丝状真菌的集合。白腐菌的种类很多，绝大多数为担子菌，少数为子囊菌。属于担子菌门(Basid1mycota)，包括非裙菌(Aphy I 1phorales)、伞菌(Agaricales)等200多个品系。白腐菌是目前已知的自然界中唯一能彻底降解木质纤维素的微生物。
[0005]利用白腐菌专一性地降解木质素，以去除木质素和半纤维素(木质纤维素中最易被降解的成分)对纤维素的包裹，达到提高纤维素或半纤维素的可及度，并在纤维素酶和半纤维素酶的作用下降解纤维素和半纤维素，是目前木质纤维素生物转化和利用的最有潜力的途径之一。在自然界中，白腐菌能够产生木质素水解酶系，将木质素降解为C02，并在木质纤维素的结晶区暴露出纤维素和半纤维素，再由多糖(纤维素、半纤维素)水解酶系降解纤维素和半纤维素。纤维素降解酶是一个复杂的酶系统，主要包括三类酶:内切β-l，4-葡聚糖酶;外切葡聚糖酶;葡萄糖苷酶。半纤维素可以被降解为单糖和乙酸。半纤维素降解酶是内切-β-1，4-木聚糖酶和β-1，4-木糖苷酶，此外，半纤维素的降解还需要木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶、阿拉伯呋喃糖酶和乙酰酯酶等辅助酶的作用。木质素降解酶主要有三类，即:木质素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)，此外，还包括乙二醛氧化酶和芳基醇氧化酶等。
[0006]黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是最早被发现、其木质纤维素降解酶被研究最多的木质素降解白腐菌，大部分的固态发酵研究集中在黄孢原毛平革菌的降解作用和应用。近年来，研究发现其他白腐菌如Lentinus edodes(香燕),Pycnoporuscinnabarinus,Crinipellis sp.RCK-1,Ceripor1psis subvermispora,PhIebiabrevispora,Pleurotus ostreatus在培养中产生木质纤维素降解酶，并对木质素的降解具有选择性。只有很少的白腐菌种类能同时产生三种酶，一些仅产生两种甚至一种，根据文献3对87种白腐菌的列表显示，大部分的白腐菌都能产生漆酶Lac(E.C.1.10.3.2)，其次是锰过氧化物酶MnP(E.C.1.11.1.1 3 )，例如作为选择性降解木质素的模型白腐真菌Ceripor1psis subvermispora、Dichomitus squalens、Pleurotus ostreatus都只产生Lac和Mn P，而不产生木质素过氧化物酶Lip，只有很少的白腐菌能产生LiP(E.C.1.11.1.14)，实际上，在天然木质纤维素上白腐菌LiP的表达很难检测。研究表明不同来源植物的木质素需要不同比例的三种酶来提高降解效率。尽管漆酶是研究最多的木质素降解酶，但是漆酶仅能直接氧化酚型木质素单体，这类木质素单体仅构成少于10%的天然木质素聚合物。相反，木质素过氧化物酶是迄今为止最有效的氧化剂木质素降解酶，能够催化酚型或非酚型化合物、芳香氨、芳香酯和多环芳香碳氢化合物的氧化降解。因此，新发现能产生Lip的白腐菌、以及促进白腐菌两种或以上木质素降解酶的同时产生和酶活力的方法是研究方向之一。
[0007]目前对一些白腐菌(不包括桦褐孔菌)培养基和培养条件优化包括(I)木质纤维素基质类型:不同木质纤维素材料的木质素、半纤维素、纤维素三个组分的比例和物理、化学结构的不同会造成白腐菌降解不同类型木质纤维素效率上的差异。(2)碳氮源:它们影响白腐菌的生长和降解酶的产生和分泌，而且为了提高性价比，应尽可能选择价格便宜的碳氮源。(3)营养限制:有研究认为限制碳氮源能促进降解酶的产生，有的研究结论是营养限制不起作用，矛盾的结果可能源于不同的木质纤维素材料和白腐菌。(4)诱导剂的作用:金属离子如铜促进漆酶的产生、锰促进锰过氧化物酶的产生。一些小分子化合物如酚酸类化合物，黄酮类化合物，以及作为底物的化合物能促进木质素降解酶的产生。
[0008]桦褐孔菌，又名白桦鸾，学名Inonotusobiiquus,Fuscoporia oblique，是一种多孔菌科褐卧孔菌属食药用白腐真菌。桦褐孔菌主要生长于白桦、银桦、榆树、赤杨等活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上，形成不育的木腐菌，其菌核可以在砍伐后的枯干上生存达6年之久。桦褐孔菌子实体一般呈瘤状，直径约25-40cm，外表坚硬，有深的裂痕，较硬，干时脆，颜色呈黄褐色或更深。主要分布于俄罗斯北部、北欧、中国黑龙江、吉林长白山、日本北海道等北玮45-50°极寒地区，是极其耐寒的菌种，能在零下69°C的环境下生长，生长期达15年。
[0009]野生的桦褐孔菌成年菌会吸干桦树等寄主的精华，导致树木干枯，故而其自然资源十分稀缺，其价格在国际市场上远胜珍贵药用真菌桑黄。而且目前尚没有有效的方法人工培育菌核和子实体，因此采用液体深层发酵培养菌丝体获得活性成分或酶是一个可行的代替方法。采用液体深层发酵的方法，和传统的真菌培育方法相比，具有生产周期短、成本低、产量质量稳定、产品可以控制等优越性。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种液体深层发酵法生产桦褐孔菌木质纤维素降解酶的工艺，具有发酵时间短、不容易感染杂菌、木质纤维素降解酶易于提取纯化等优点。
[0011]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0012]—种液体深层发酵法生产桦褐孔菌木质纤维素降解酶的工艺，包括如下步骤:
[0013](I)菌种活化:以桦褐孔菌为菌种，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种；
[0014](2)液体菌种培养:将活化菌种转入液体种子培养基中，摇床培养至对数期得液体菌种；
[0015](3)液体深层发酵:将液体菌种接入液体深层发酵培养基中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8-10，所述液体深层发酵