一种重组褐藻胶裂合酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种重组褐藻胶裂合酶的制备方法。具体地，本发 明涉及一种利用重组大肠杆菌制备褐藻胶裂合酶的方法。
【背景技术】
[0002] 铜绿假单胞菌aeri/giflosa，又称绿脓杆菌）是临床最常见的条件致 病菌之一，可导致多种急性和慢性感染，如囊性纤维化（白种人人群中最普遍的遗传病）病 人和弥漫性泛细支气管炎患者的慢性肺炎，以及细菌性心内膜炎、角膜炎、慢性中耳炎、胆 道感染和尿路感染等。由铜绿假单胞菌引起的医院内感染占10%~30%，而下呼吸道感染率 更高，居病原菌之首。近年来随着各种假体、移植物等生物材料和各种内置式导管的广泛应 用，铜绿假单胞菌导致的感染日趋增多。
[0003] 铜绿假单胞菌的耐药性有多种机制，包括：生物被膜（Biofilm)形成、抗生素修饰 酶的生成、青霉素结合蛋白改变、外膜低渗透、外膜孔蛋白缺失和主动外排泵系统等，其中 生物被膜的形成是铜绿假单胞菌产生抗生素耐药的主要原因之一。生物被膜是指由附着于 组织或生物材料表面的细菌细胞和包裹着细菌的由细菌自身所分泌的含水聚合性基质所 组成的结构性细菌群落，是细菌生长过程中为适应生存环境而形成的一种与浮游细胞相对 应的存在形式。铜绿假单胞菌极易形成生物被膜，形成了生物被膜的铜绿假单胞菌具有极 强的耐药性（比游离的细菌提高100 - 1000倍)和抵抗机体免疫系统作用的能力，造成临床 上难治性、持续性感染。
[0004] 铜绿假单胞菌的生物被膜由胞外多聚物包括乙酰化褐藻胶（acetylated alginate)、DNA、蛋白质等成分组成，其中乙酰化褐藻胶是生物被膜的主要组成部分，决定 了生物膜的结构和功能，并且决定了生物被膜的物理性质与生物学特性。褐藻胶裂合酶 (alginate lyase)可通过β -消去反应催化褐藻胶的降解，在非还原性末端生成C4, 5双 键。但绝大多数褐藻胶裂合酶不能降解铜绿假单胞菌产生的乙酰化褐藻胶。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用重组大肠杆菌制备褐藻胶裂合酶的方法。
[0006] 本发明的褐藻胶裂合酶制备方法是通过如下技术方案实现的。
[0007] 大肠杆菌 BL21 (DE3) /pET24-algL 在 LB 培养液中 30-37°C 100-300 r/min 振荡培 养至0D_=0. 5-2. 0,按照1-10% (v/v)的接种量接种到装有LB培养基的发酵罐中，当菌体 长至0D6QQ=0. 5-5. 0时，加入终浓度为0. 1-1. 0 mM的IPTG，在15-20°C诱导24-72 h ;将发酵 液离心，收集菌体，超声破碎细菌，上清液上样于镍离子亲和层析柱，用咪唑梯度洗脱，收集 活性组分。
[0008] 本发明所用的a办Z基因可利用中国发明专利申请03138824. 8提供的方法制备。 发酵液体积为1-1000 L。
[0009] 本发明的纯化方法可以得到纯度95%的褐藻胶裂合酶，回收率达到70%以上，具有 工艺简单、容易控制、纯化效果好、回收率高、成本低的优点。
【附图说明】
[0010] 图1 :大肠杆菌BL21(DE3)/pET24-algL在5 L发酵罐中的发酵曲线。
[0011] 图2 :纯化后的褐藻胶裂合酶的SDS-PAGE图谱。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1利用重组大肠杆菌发酵生产褐藻胶裂合酶AlgL。
[0013] 将保存在-80°C的大肠杆菌BL21 (DE3) /pET24-algL在LB平板上划线，30-37°C培 养过夜；挑取单克隆至LB培养液中，30-37°C 100-300 r/min振荡培养至0D6M=0. 5-2. 0,根 据发酵罐体积决定种子液体积和转接次数；按照1-10% (v/v)的接种量接种到5 L发酵罐 中，发酵罐中装入LB培养基，装液量为50-80%，初始通气为1 vvm，初始搅拌转速为350 r/ min，温度控制为30-40 °C，pH控制在6. 0-8. 0,通过调节通气量和转速控制溶氧在15-40% ; 当菌体长至0D6QQ=0. 5-5. 0时，加入终浓度为0. 1-1. 0 mM的IPTG，在15-20°C诱导24-72 h。
[0014] 实施例2重组褐藻胶裂合酶AlgL的纯化。
[0015] 将发酵液0-30 °C 3000-12000 r/min离心5-30 min，收集菌体，重悬于含有500 mM NaCl的50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7. 6);利用超声完全破碎细菌，0-30 °C 3000-12000 r/ min离心5-30 min,收集上清液；上清液上样于镍离子亲和层析柱，用咪唑梯度洗脱，收集 洗脱组分，根据酶活测定结果合并活性组分；活性组分对50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.6)进 行透析过夜，分装后储存在_20°C。
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【主权项】
1. 一种重组褐藻胶裂合酶的制备方法，其特征在于，该方法包括： (1) 将保存在-80°C的大肠杆菌BL21 (DE3)/pET24-algL在LB平板上划线，30-37°C培 养过夜； (2) 挑取单克隆至LB培养液中，30-37°C 100-300 r/min振荡培养至0D6M=0. 5-2. 0,根 据发酵罐体积决定种子液体积和转接次数； (3) 按照1-10% (v/v)的接种量接种到发酵罐中，发酵罐中装入LB培养基，装液量为 50-80%，初始通气为1 vvm，初始搅拌转速为350 r/min，温度控制为30-40 °C，pH控制在 6. 0-8. 0,通过调节通气量和转速控制溶氧在15-40% ;当菌体长至0D6QQ=0. 5-5. 0时，加入终 浓度为 〇· 1-1. 〇 mM 的 IPTG，在 15-20°C诱导 24-72 h ; (4) 将发酵液离心，收集菌体，重悬于含有500 mM NaCl的50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7. 6);利用超声完全破碎细菌，离心，收集上清液；上清液上样于镍离子亲和层析柱，用咪唑 梯度洗脱，收集洗脱组分，根据酶活测定结果合并活性组分；活性组分对50 mM磷酸盐缓冲 液（pH 7. 6)进行透析过夜，分装后储存在-20°C。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心转速为3000-12000 r/min，离心 温度为0-30 °C，离心时间为5-30 min。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵罐体积从1升到1000升。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所得到的重组褐藻胶裂合酶AlgL纯度达到 95%，回收率达到70%以上。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及一种重组褐藻胶裂合酶的制备方法。本发明将重组大肠杆菌在发酵罐中进行培养，加入诱导剂诱导产酶；离心收集菌体，超声破碎后离心，收集上清液，利用亲和层析得到纯度95%的褐藻胶裂合酶，回收率达到70%以上。本发明的制备方法适用于中试和产业化生产褐藻胶裂合酶，具有工艺简单、容易控制、纯化效果好、回收率高、成本低的优点。
【IPC分类】C12R1/19, C12N9/88
【公开号】CN105624136
【申请号】CN201410595013
【发明人】于文功, 韩峰, 路新枝
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年10月30日