一种用于高难接触性检材dna提取纯化的试剂盒及方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及一种可以有效进行高难接触性检材中DNA提取的试剂盒及方法，属于 生物和医学检验技术领域。
【背景技术】
[0003] DNA检验技术是目前法医检验技术的重要组成，通过对案件现场采集的DNA样本进 行测序分析，利用STR(短串联重复序列)分型技术可以准确的进行个体识别，从而为案件侦 破和法庭审判提供强有力的证据支持。通常情况下，法医DNA检验包含DNA样本的采集、DNA 提取和纯化、扩增和测序等几个步骤，其中DNA的提取和纯化是后续检验的前提，对能否获 得有效STR分型起到至关重要的作用。对于DNA含量较高的案件检材，例如血斑、组织、精斑、 唾液等，采用常规方法(如Chelex 100法等)可以有效的实现DNA的提取和纯化。但随着法医 DNA技术的发展，对案件中接触性检材中DNA提取纯化的需求越来越多。所谓接触性检材是 指通过皮肤接触物体后遗留在物体上的脱落细胞构成的检材，例如指纹、掌纹、手套、接触 的衣物等。接触性检材在案件现场中变化多样，其DNA含量也大不相同。如现场遗留的单枚 指纹，DNA含量要远少于多次触摸的痕迹。如嫌犯带手套作案，经手套触摸物体二次转移遗 留的脱落细胞则更为稀少。另外，从现场采集接触性检材不可避免的会掺杂各种杂质(如灰 尘、泥土、铁锈等）。目前，单枚指纹，二次转移检材和高杂质检材均被称为高难接触性检材， 采用常规方法，甚至采用一些常规提取试剂盒都无法有效的进行DNA提取和纯化。而这些高 难接触性检材在案件侦破中往往是至关重要的证据来源，无法有效对其进行DNA提取直接 导致高难接触性检材DNA检出率很低，无法满足日益增长的案件检验需求。
[0004] 针对以上情况，有必要开发一种兼具高提取灵敏度和强除杂能力的DNA提取纯化 试剂盒，并依据该试剂盒建立能够完成高难接触性检材中DNA提取纯化的有效方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是提供一种可以有效进行高难接触性检材中DNA提取的试剂盒及 方法，该试剂盒具有提取灵敏度高，抗杂质影响能力强，易于操作等优点。
[0006] 本发明的试剂盒及提取方法采用纳米磁珠作为提取DNA的介质，基于高难接触性 检材中DNA含量低和杂质含量高的两个难点，设计了提取试剂体系和相应方法，从而实现从 高难接触性检材中有效的获得DNA样本。本发明的第一个技术创新是优化DNA吸附体系提高 磁珠对DNA的吸附能力，从而提高提取灵敏度。本发明的另一个重要技术创新是，针对吸附 DNA后的磁珠设计了全新的洗涤体系和洗涤方法。该洗涤方法除了能够有效除去DNA以外的 杂质（如蛋白、金属离子、固体颗粒等），更重要是通过采用极性和离子强度递减的洗涤液， 通过顺序洗涤的方式，将吸附在磁珠上的短片段无效DNA洗脱，保留包含STR信息的长片段 DNA。这样做的好处是，在后续PCR扩增反应中，由于剔除了短片段无效DNA对PCR反应的竞争 作用，可以使STR有效DNA片段充分扩增，提高有效片段的扩增数量可大大增强最终毛细管 电泳的有效信号，从而使高难接触性检材DNA检出率得到有效提升。
[0007] 本发明所说的一种用于高难接触性检材DNA提取纯化的试剂盒，其特征在于:是由 消化液、吸附液、洗涤液1、洗涤液2、洗涤液3、磁珠混悬液和洗脱液七部分组成； 其中，所述的消化液的组成为异硫氰酸胍(2.0~5.0 M)，盐酸胍(0.1~0.5 M)，Tris HCl(0.02~0.04M)，Tween80(7.0X10-3~1.4X10-2M)，EDTA(2.0X10- 3~5.0X10-3 M)，SDS (3.0X10-3 ~1.5X10-2 M); 所述的吸附液组成为异硫氰酸胍(2.0~5.0M)，Tris HC1(0.02~0.04 M)，乙二醇（1.5~ 2.5 M)； 所述洗涤液1的组成为异硫氰酸胍（2.0~5.0M)，Tris HC1(0.02~0.04 M)，乙二醇 (3.0~4.0 M); 所述洗涤液2的组成为无水乙醇：异丙醇：水=7 :1: 2(体积比），加入NaCl至浓度为2.0 M； 所述洗涤液3的组成为无水乙醇：异丙醇：水=6 : 2: 2(体积比），加入NaCl至浓度为0.5 M； 所述磁珠混悬液为尺寸100~2000nm的超顺磁性纳米磁珠，分散在高纯水中，浓度为9% (质量百分比）； 所述洗脱液为高纯水。
[0008] 所述的吸附液其作用为提供DNA与磁珠的吸附结合环境，本发明的吸附液体系特 征在于通过添加乙二醇，优化调控吸附液体系的极性，增强磁珠与DNA间的吸附作用。
[0009] 所述洗涤液其作用为通过洗涤操作，去除磁珠吸附的除DNA以外的杂质。本发明的 洗涤液特征在于，通过优化设计的极性和离子强度梯度变化的洗涤液体系，在实现杂质充 分洗涤的基础上，进一步实现了对短片段无效DNA的选择性洗脱，从而提升了有效DNA的提 取质量。洗涤液体系分为洗涤液1、洗涤液2、洗涤液3三个不同组成。
[0010] 所述磁珠混悬液为超顺磁性纳米磁珠，尺寸在1〇〇~2000nm间，分散在高纯水中，浓 度为9%(质量百分比）。
[0011] 本发明所说的一种用于高难接触性检材DNA提取纯化的试剂盒的制备方法，包括 以下步骤： 按比例分别称取配制消化液、吸附液、洗涤液1、洗涤液2、洗涤液3、磁珠混悬液和洗脱 液涉及的试剂，按常规的配制方法分别混合均匀即可。
[0012] 本发明所述用于高难接触性检材DNA提取纯化的试剂盒的使用方法，包括以下步 骤： 1) 取合适大小的接触性检材放入离心管中，加入100~1000 μL消化液，按照体积比 10 :1~20 :1的比例加入10 mg/ml的蛋白酶Κ水溶液;颠倒混后，置于56°C温浴0.5小时~6小 时； 2) 温浴后，离心12000 rpm，3分钟；取出上清置于新的离心管中，向上清液中加入1~ 10倍上清体积的吸附液，再加入5~30 μL磁珠混悬液;在翻转式混匀仪上室温连续混匀吸 附10~20分钟； 3) 将离心管置于磁力架上进行磁分离，吸弃管中液体，保留磁珠； 4) 向离心管中加150~400 μL洗涤液1，盖上离心管盖，旋涡振荡混匀后立即放回磁 架，吸弃液体； 5) 向离心管中加150~500 μL洗涤液2,盖上离心管盖，旋涡振荡混匀后立即放回磁 架，吸弃液体； 6) 向离心管中加150~500 μL洗涤液3,盖上离心管盖，旋涡振荡混匀后立即放回磁 架，吸弃液体，开盖室温干燥5~15分钟； 7) 加入10~30 μL洗脱液，旋涡振荡混匀后立即放到磁架上，待磁珠完全吸附到离心 管管壁上，吸出溶液放于另一离心管中保存待用。
[0013] 本发明的积极效果在于:DNA提取灵敏度高，可以有效的从仅含微少量DNA的高难 接触性检材中完成DNA的提取纯化。抗杂质干扰能力强，对含灰尘、泥土等杂质的检材提取 DNA效果好，纯度高。操作简便，可以和自动化提取仪器配合，提高工作效率。
【附图说明】
[0014] 图1.实施例1中提取的DNA样本的STR谱图； 图2.实施例2中提取的DNA样本的STR谱图。
【具体实施方式】
[0015] 借助以下实施例对本发明做进一步描述，应理解，以下实施例是示范性的，而不是 限制性的，可根据上述发明的技术方案和实际情况，来确定具体的实施方法。
[0016] 实施例1 本发明可以有效进行高难接触性检材中DNA提取纯化的试剂盒，包括消化液、吸附液、 洗涤液1、洗涤液2、洗涤液3、磁珠混悬液和洗脱液七部分组成； 所述的消化液的组成为异硫氰酸胍（2.0 Μ)，盐酸胍(0.1 M)，Tris HC1(0.02 Μ)， Tween 80 (7.0X10-3 M)，EDTA (2.0 X10-3 M)，SDS (3.0X10-3 M); 所述的吸附液组成为异硫氰酸胍(2.0 M)，Tris HC1(0.02 Μ)，乙二醇（1.5 M); 所述洗涤液1的组成为异硫氰酸胍(2.0 M)，Tris HC1(0.02 M)，乙二醇（3.0 M); 所述洗涤液2的组成为，按体积比配置，无水乙醇：异丙醇:水=7:1:2;加入NaCl至浓度 为2.0 M; 所述洗涤液3的组成为，按体积比配置，无水乙醇：异丙醇:水=6:2: 2;加入NaCl至浓度 为0.5 M; 所述磁珠混悬液为超顺磁性纳米磁珠，尺寸在100~2000nm间，分散在高纯水中，浓度为 9%(质量百分比）； 所述洗脱液为高纯水； 按比例分别称取配制消化液、吸附液、洗涤液1、洗涤液2、洗涤液3、磁珠混悬液和洗脱 液涉及的试剂，按常规的配制方法分别混合均匀即可。
[0017] 实施例2 本发明所说的一种可以有效进行高难接触性检材中DNA提取纯化的试剂盒，包括消化 液、吸附液、洗涤液1、洗涤液2、洗涤液3、磁珠混悬液和洗脱液七部分组成： 所述的消化液的组成为异硫氰酸胍（5.0 M)，盐酸胍(0.5 M)，Tris HC1(0.04 M)， Tween 80 (1.4X10-2 M)，EDTA (5.0 ΧΙΟ-3 M)，SDS (1.5X10-2 M); 所述的吸附液组成为异硫氰酸胍(5.0 M)，Tris HC1(0.04 M)，乙二醇（2.5 M); 所述洗涤液1的组成为异硫氰酸胍(5