一种引物组及其在扩增siv/shiv基因组中的应用与试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种引物组及其在扩增SIV/SHIV基因组中 的应用与试剂盒。
【背景技术】
[0002] 艾滋病，又称为获得性免疫缺陷综合症（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的一 类死亡率极高的传染性疾病，对全球、尤其是亚洲和非洲等广大发展中国家人民的生命健 康安全威胁极大。HIV最独特的特征之一就是基因组的高变异性。基于基因变异，流行于全 球的HIV-1分为四组，Μ组、0组、N组和P组，Μ组内又可分为A~J 10个亚型，各亚型间的基因 离散率是20%~35%，同时，还有数十种循环重组型存在。病毒基因组基因分析在HIV研究 的很多重大发现中扮演了重要角色，而且高水平的基因变异分析也是艾滋病广谱疫苗研发 的重要障碍。因此，高水平的病毒基因获取技术对HIV研究至关重要。
[0003] SIV(Simian immunodeficiency virus)是一种猴免疫缺陷病毒，发现于非洲灵长 类动物，与HIV-1 病毒非常相似。SHIV(Simian-Human immunodeficiency virus)是人/猿嵌 合免疫缺陷病毒，是应用分子生物学技术将HIV-1重要基因与SIV重组成的嵌合体病毒。由 于恒河猴感染SIV和人感染HI V-1存在着相似性，继而发展出的症状也和AIDS相似，这些特 点可以使SIV/恒河猴动物模型用于HIV/AIDS研究。因此，SIV、SHIV病毒基因组序列的获得 及分析就显得尤为重要。
[0004] 起初，人们使用普通PCR(Bulk PCR)扩增早期血浆病毒以获得SIV或SHIV病毒的基 因组片段，然后进行Sanger测序。该方法具有简单、易操作及成本低等优势，也得到了急性 期和早期病毒群体的大概复杂性。但是，由于SIV病毒或SHIV病毒的基因组序列长度较长， 约为lOOOObp，普通的PCR技术往往存在重组、序列选择及扩增序列有限的问题，这就使扩增 所获得的片段会产生一定的突变，降低了精确度，给后续序列分析造成困扰。
[0005] 因此，需要进一步研究能够精确扩增SIV或SHIV病毒基因组的引物。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种引物组及其在扩增SIV/SHIV基 因组中的应用与试剂盒，本发明提供的引物特异性好，精确度高、敏感性高。
[0007] 本发明提供的引物组包括SEQ ID NO: 1~4所示核苷酸序列的4条引物和/或SEQ ID N0:5~8所示核苷酸序列的4条引物。
[0008] 本发明提供的引物组在扩增SIV/SHIV基因组的中的应用。
[0009] 本发明提供的引物组根据SIVmac239全基因组序列（Genbank NO.M33262)保守区 设计，分别位于LTR和Pol区。其中，SEQ ID N0:1~4所示核苷酸序列的4条引物用于扩增 SIV/SHIV基因组的5'半长(基因组全长的509位~6236位，共计5728bp)，SEQ ID N0:5~8所 示核苷酸序列的4条引物用于扩增SIV/SHIV基因组的3'半长(基因组全长的5244位~10087 位，共计4844bp)。以本发明提供引物组扩增得到的5'半长和3'半长存在重复序列，经测序 后能够拼接获得完整的SIVmac239全基因组序列。
[0010] 本发明提供的引物组能够具有特异性的、稳定而准确的扩增出目标序列。经琼脂 糖凝胶电泳检测，未见非特异性条带产生，未见拖尾或弥散现象产生。经测序后与Genbank 中登录的SIVmac239全基因组序列比对，匹配度为100%，未见碱基置换或缺失(gap)。
[0011] 实验表明，本发明提供的引物组对SIV/SHIV基因组具有良好的灵敏性，在病毒拷 贝数为lO13· 5^4·13之间皆能起到良好的检测效果，分析认为灵敏性的差异性与病毒序列变异 度有关。
[0012] 本发明还提供了扩增SIV/SHIV基因组的试剂盒，包括本发明提供的的引物组。
[0013] 本发明提供的引物组以质粒DNA为模板，也可以动物血浆逆转录来的病毒cDNA为 模板。作为优选，以病毒cDNA为模板。因此，需提取病毒RNA逆转录制备cDNA。
[0014] 本发明提供的试剂盒中还包括SEQ ID N0:9所示核苷酸序列的逆转录引物。
[0015] 本发明提供的试剂盒中还包括Superscript III酶和High Fidelity Taq酶。
[0016] 其中，Superscript III酶为逆转录酶。
[0017]本发明提供的试剂盒中还包括巢式PCR常用的缓冲液、底物，例如:PCR buf f er、 Mg2+、dNTP〇
[0018] 本发明提供了扩增SIV/SHIV基因组的方法，其特征在于，包括：以待测样品的cDNA 为模板，以本发明提供的引物组扩增。
[0019] 在本发明实施例中，扩增采用巢式PCR分别扩增SIV/SHIV基因组的5'半长、3'半 长。
[0020] 本发明中SIV/SHIV基因组的5'半长的扩增包括：
[0021]步骤1:以待测样品的cDNA为模板，以SEQ ID NO: 1~2所示核苷酸序列的引物扩 增，获得中间产物；
[0022]步骤2:以中间产物为模板，以SEQ ID NO: 3~4所示核苷酸序列的引物扩增，获得 SIV/SHIV基因组的5'半长。
[0023] 退火温度(Annealing Temperature)为引物和模板结合时候的温度参数，当50% 的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度，它是影响PCR特异性的较重要因素。
[0024] 作为优选，步骤1中扩增的退火温度为60°C~62°C，步骤2中扩增的退火温度为60 Γ。
[0025] 优选的，步骤1中的扩增程序为：
[0026]
[0027]或
[0028]
[0029]
[0030] 优选的，步骤1中的扩增体系为：
[0031]
[0032]
[0033]
[0034]
[0035]
[0036]在本发明中，SIV/SHIV基因组的3'半长的扩增包括：
[0037]步骤1:以待测样品的cDNA为模板，以SEQ ID N0: 5~6所示核苷酸序列的引物扩 增，获得中间产物；
[0038]步骤2:以所述中间产物为模板，以SEQ ID N0:7~8所示核苷酸序列的引物扩增， 获得SIV/SHIV基因组的3'半长。
[0039] 作为优选，步骤1中扩增的退火温度为64°C，步骤2中扩增的退火温度为60°C。
[0040] 优选的，步骤1中的扩增程序为：
[0041]
[0042]
[0043]
[0044]
[0045]
[0046]
[0047]
[0048] 在本发明中待测样品为血浆、组织、细胞或质粒。
[0049] 本发明提供了用于扩增SIV/SHIV基因组的引物组，该引物组能够有效扩增SIV或 SHIV的基因组。本发明提供的引物组能够具有特异性的、稳定而准确的扩增出目标序列。经 琼脂糖凝胶电泳检测，未见非特异性条带产生，未见拖尾或弥散现象产生。经测序后与 Genbank中登录的SIVmac239全基因组序列比对，匹配度为100%，未见碱基置换或缺失 (gap)。实验表明，本发明提供的引物组对SIV/SHIV基因组具有良好的灵敏性，在病毒拷贝 数为之间皆能起到良好的检测效果，分析认为灵敏性的差异性与病毒序列变异度 有关。
【附图说明】
[0050]图1示实施例1扩增产物的电泳图；其中，泳道1~8依次示引物对1~8的扩增效果， 泳道W示以水为阴性对照的电泳，泳道Μ示marker;
[00511图2-a示实施例2各组引物以SIVmac239质粒为模板扩增产物(3'半长）的电泳图； 其中泳道1~5依次示对照组1~5引物的扩增效果;泳道6示实验组1引物的扩增效果;泳道N 示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道Μ示marker;
[0052] 图2-b示实施例示表2各组引物以SIVmac239质粒为模板扩增产物(5'半长）的电泳 图；其中泳道1~2依次示对照组6~7引物的扩增效果;泳道3示实验组2引物的扩增效果;泳 道4~6示对照组8~10引物的扩增效果；泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道Μ示 marker；
[0053] 图3-a示表2各组引物以SHI V-KB9质粒为模板扩增产物(3 '半长)的电泳图；其中泳 道1~5依次示对照组1~5引物的扩增效果;泳道6示实验组1引物的扩增效果;泳道N示阴性 对照，泳道P示阳性对照，泳道Μ示marker;
[0054] 图3-b示表2各组引物以SHI V-KB9质粒为模板扩增产物(5 '半长)的电泳图；其中泳 道1~2依次示对照组6~7引物的扩增效果;泳道3示实验组2引物的扩增效果;泳道4~6示 对照组8~10引物的扩增效果;泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道Μ示marker;
[0055] 图4-a示表2实验组2引物对的退火温度检测；泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对 照，泳道Μ示marker;
[0056] 图4-b示表2实验组1引物对的退火温度检测；泳道Μ示以SIVmac239质粒为模板;泳 道K示以SHI V-KB9质粒为模板;泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道Mr示marker;
[0057] 图5-a示以实验组2的引物组扩增不同模板的扩增效果，S1~S9示以不同毒株感染 的细胞上清为模板的编号，其中，S1为SIVmac239感染的细胞上清为模板，S2为SIVmac239-973感染的细胞上清为模板，S3为SIVmac251感染的细胞上清为模板，S3为SHIV-CN97001感 染的细胞上清为模板，S4为SHI