氯胺酮核酸适体、检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域和刑事鉴定技术领域。具体地，本发明涉及氯胺酮核酸 适体、检测试剂盒及其应用，尤其在在毒物检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 氯胺酮[2-氯苯-2-甲基胺环己酮]是一种高效麻醉剂，服用后能产生"分离性幻 觉"，因此在很多社交场合和性侵犯案件中成为很常见的滥用药物。氯胺酮的分析检测手段 有很多也很成熟，包括GC - MS，LC - MS/MS。尽管目前这些方法都对氯胺酮的检测有很好的 灵敏性和特异性，但是都需要昂贵的仪器设备，不能快速、现场检测氯胺酮。此外，现有的免 疫检测方法容易与美沙酮、美沙芬发生交叉反应。
[0003] 近年来，现场快速检测毒品的方法是以单克隆抗体为基础，取得了良好的效果。但 是，单抗的检测仍然存在一定的局限性：
[0004] 一，单抗来源于动物，因此，在制备单抗时会出现某些限制；如，某些毒品、毒物的 毒性为动物无法忍受，还有某些免疫性很差的小分子都会给制备单抗带来困难。
[0005] 二，杂交瘤的制备仅限于大小鼠和兔子，大大限制了抗体的应用。不同来源的抗体 应用于检测，可能会发生非特异的结合所产生假阳性结果。
[0006] 三，单克隆抗体的制备工作量较大，对某些稀有的抗体需要筛选大量的克隆，成本 较昂贵。
[0007] 四，抗体制备有自身的缺陷，细胞株必须冻藏，如冻藏不好极易发生意外细胞死 亡。
[0008] 五，通常扩增单克隆抗体是通过将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内产生腹水，从腹 水中纯化抗体。但是，某些杂交瘤细胞很难产生腹水，限制了抗体的产生。
[0009] 六，每批生产的抗体的表现都不同，免疫检测试剂每一批新抗体都要重新调试。
[0010] 七，抗体识别都是在生理条件下进行，抗体与抗原的结合动力学参数无法根据需 要而改变。
[0011] 最重要的是，氯胺酮代谢迅速，尿中的氯胺酮原体含量很低，要求高度灵敏的检 测，而这些抗体无法实现。
[0012] 综上，本领域尚缺乏令人满意的高灵敏度的、可适用现场检测的氯胺酮的检测方 法，因此迫切需要研制开发具有灵敏、快速、可靠、特异性佳等优点的氯胺酮的检测技术。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是提供一种灵敏、快速、可靠、特异性佳等优点的氯胺酮的技术。
[0014] 在本发明的第一方面，提供了一种核酸适体，所述的适体特异性结合于氯胺酮。
[0015] 在另一优选例中，所述的特异性结合指所述适体结合于氯胺酮但不结合于以下任 何一种物质：美沙酮、美沙芬、甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA、MDA、吗啡、可待因、海洛因、福尔 可定、单乙酰吗啡、二氢可待因、二氢埃托菲、雷米替丁、哌替啶、芬太尼、曲马多、右丙氧芬、 纳洛酮、纳曲酮、烯丙吗啡、可乐宁、洛非西丁、东莨菪碱、益安口服液、正通宁片、扑热息痛、 阿斯匹林、布洛芬、阿米替林、丙米嗪、氯丙嗪、异丙嗪、水合氯醛、安定、三唑仑、阿普唑仑、 苯巴比妥、速可眠、异戊巴比妥、咖啡因、氟哌酸、先锋IV、黄连素、乳糖、普鲁卡因、康复新胶 囊、水合氯醛、奥复沙星、非那西丁、去痛片、度冷丁、麻黄素、左旋麻黄素、右旋麻黄素、蒂巴 因、四氢大麻酚、利多卡因、那可丁、丁丙诺啡、苯丙醇胺和苯乙胺。
[0016] 在另一优选例中，所述的适体是通过SELEX技术，从ssDNA文库中筛选获得的单链 核酸分子。
[0017] 在另一优选例中，所述的适体包括DNA、RNA、或DNA/RNA杂合分子。
[0018] 在另一优选例中，所述的适体的长度为30-100个碱基。
[0019] 在另一优选例中，所述的适体为单链或双链。
[0020] 在另一优选例中，所述的适体带有可检测标记物。
[0021 ] 在另一优选例中，所述的适体是分离的或纯化的。
[0022] 在另一优选例中，所述的适体的纯度彡90%，较佳地彡95%，更佳地彡99%。
[0023] 在另一优选例中，所述的适体的序列如SEQ ID N0. : 1、2、3、或4所示。
[0024] 在本发明的第二方面，提供了一种偶联物，所述偶联物包括本发明第一方面所述 的核酸适体以及与所述核酸适体相连的可检测标记物。
[0025] 在另一优选例中，所述的可检测标记物包括生物素、化学发光基团、化学荧光基 团、荧光蛋白、酶、胶体金、放射性同位素、乳胶颗粒、抗体、配体、抗原、受体、或其组合。
[0026] 在本发明的第三方面，提供了一种复合物，所述的复合物是（a)本发明第一方面 所述的核酸适体或本发明第二方面所述的偶联物与（b)氯胺酮所形成的复合物。
[0027] 在本发明的第四方面，提供了一种检测制品，所述检测制品含有本发明第一方面 所述的核酸适体或本发明第二方面所述的偶联物。
[0028] 在另一优选例中，所述的检测制品包括：检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板。
[0029] 在另一优选例中，所述的检测制品用于检测氯胺酮。
[0030] 在本发明的第五方面，提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含本发明第一 方面所述的核酸适体，本发明第二方面所述的偶联物和/或本发明第四方面所述的检测制 品。
[0031] 在本发明的第六方面，提供了如本发明第一方面所述的核酸适体或本发明第二方 面所述偶联物的用途，它们被用于制备检测氯胺酮的检测制品或试剂盒。
[0032] 在另一优选例中，所述的检测制品包括：检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板。
[0033] 在本发明的第七方面，提供了一种检测氯胺酮的方法，包括以下步骤：
[0034] (a)提供待检测的样品；
[0035] (b)将该样品与本发明第一方面所述的核酸适体或本发明第二方面所述的偶联物 混合，形成混合物；
[0036] (c)检测所述混合物中"氯胺酮-核酸适体复合物"的存在与否，其中如果存在所 述复合物，则表明所述样品中存在氯胺酮；如果不存在所述复合物，则表明所述样品中不存 在氯胺酮。
[0037] 在另一优选例中，所述的检测包括定性检测和定量检测。
[0038] 在另一优选例中，在步骤（c)中，包括与标准品或标准曲线进行比较，从而确定在 所述混合物中是否存在复合物，和/或所述复合物的数量。
[0039] 在另一优选例中，所述方法用于毒品检测、药物检测或食品安全检测，更优选的， 所述方法用于毒品检测。
[0040] 在本发明第八方面，提供了 一种核酸序列，所述核酸序列是序列如SEQ ID NO. :1-4所示序列的反义序列。
[0041] 在本发明第九方面，提供了一种组合物，所述的组合物含有（i)载体以及（ii)本 发明第一方面所述的核酸适体、本发明第二方面所述的偶联物。
[0042] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0043] 图1显示了 PCR条件优化产物2%琼脂糖凝胶电泳结果。
[0044] 图2显示了适体对氯胺酮的结合性检测。MB:裸磁珠；MB-氯胺酮：偶联氯胺酮的 磁珠。
[0045] 图3显示了 SEQ ID N0. : 1-4的特异性的检测。
[0046] 图 4 显示了 SEQ ID N0. : 1-2 的 Kd 值检测
[0047] 图 5 显示了 SEQ ID N0. : 1-4 的 ssDNA 的二级结构
[0048] 图6显示了本发明的一种层析侧流片（或试纸条）的结构，其中，1样品垫，2适体 释放垫，3检测线，4反应膜，5对照线，6吸收垫，和7背衬。
[0049] 图7显示了本发明一个实施例中的层析检测片的检测示意图。
【具体实施方式】
[0050] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了特异性针对氯胺酮的核酸适体。本 发明人采用SELEX技术以及磁珠筛选技术，基于特殊结构的ssDNA文库，通过十几轮的筛 选，成功地筛选得到对氯胺酮有高亲和力和高特异性的核酸适体。本发明的适体的Kd值达 到了亚微摩尔级，与常规方法筛选的适体相比，提高了 1-2个数量级。此外，本发明利用竞 争性结合的方法对适体的特异性也进行了研究，表明不会与美沙酮和美沙芬等其他毒品发 生交叉反应。本发明适体可应用于现场快速、灵敏、特异地检测氯胺酮。在此基础上完成本 发明。
[0051] 具体地，本发明人先在体外构建了全长为约78bp的ssDNA文库，进行SELEX筛选； 并利用SPR测定每轮ssDNA文库和氯胺酮的结合亲和力，通过MF0LD分析软件对适体进行 二级结构预测和结合位点分分析。通过多次试验，本发明人获得了特异性适体得到逐步富 集的文库。经过进一步测序、分析和验证，本发明人确定了多个具有茎-环结构的、与氯胺 酮存在有效结合的核酸适体。
[0052] 试验表明，本发明的氯胺酮核酸适体可特异性结合于氯胺酮并用于检测氯胺酮， 与其它药物、毒品不发生任何交叉反应，证实了本发明核酸适体具有高度的特异性和灵敏 度。在鉴别不同的毒品和类似物方面，具有重大的使用价值。
[0053] 本发明的核酸适体本身是一段单链DNA或RNA，可以耐受高温，pH值得变化，比抗 体具有更高的稳定性，易于长期保存。核酸适体还具有可体外人工化学合成、精确性高、重 复性好、无批次间差异等特点，在毒品、毒物的检测方面具有广阔的前景。
[0054] 术语
[0055] 如本文所用，术语"含有"或"包括"可以是开放式的或封闭式的，即包括了"由…… 构成"和"含有......"。
[0056] SPR
[0057] SPR(表面等离子共振，Surface Plasmon Resonance)是利用金属膜/液面界面光 的全反射连接引起的一种物理光学现象来分析生物分子间相互作用的仪器。
[0058] SELEX 筛选