一种高通量筛选产生1-脱氧野尻霉素菌株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高通量筛选产生脱氧野尻霉素菌株的方 法。
【背景技术】
[0002] 1-脱氧野尻霉素（DNJ)(图1)是一种哌啶类多羟基生物碱，能够竞争性结合蔗糖 酶、海藻糖酶、α -葡萄糖苷酶等的底物结合口袋，从而抑制其活性，降低碳水化合物的消化 和葡萄糖的产生，从而达到防治糖尿病的作用。另外，DNJ还具有抗病毒、抗肿瘤转移等功 效，对于研制糖尿病治疗的新药及开发抗病毒药物具有非常重要的学术意义和实用价值。
[0003] 天然的DNJ目前在植物（主要为桑科植物）、动物（主要包括家蚕以及食用桑叶 为主的昆虫）以及微生物（主要为链霉菌以及芽孢杆菌）都能够生成。目前合成DNJ的方 法主要是通过化学合成，以及在生物体内进行合成。链霉菌以及芽孢杆菌能够以葡萄糖为 底物通过异构、转氨、氧化、还原等步骤合成DNJ，但是从中所分离得到的DNJ的含量极低。 虽然通过基因工程菌手段和定向进化方法可以提高DNJ产量，但是由于缺乏有效的筛选手 段，难以筛选到高效合成DNJ的野生型和基因工程突变体。
[0004] 目前DNJ的检测主要采用反相高效液相色谱-紫外检测法，采用9-芴基氯甲酸甲 酯（FM0C-C1)对DNJ进行结构衍生，用荧光检测器检测生成的荧光产物，此方法虽然具有重 复性好，稳定性高等优点，但是操作繁琐、灵敏度低、经过衍生后所得的产物不太稳定等，不 适合测定低浓度，样品量少的检测，并且检测器价格比较昂贵，在应用普及方面受到较大限 制，根本不适合于DNJ高效合成菌株的高通量筛选。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供高通量鉴定高产或低产或不产脱氧野尻霉素菌株的方法。
[0006] 本发明提供的高通量鉴定高产或低产或不产脱氧野尻霉素菌株的方法，包括如下 步骤：
[0007] 1)构建表达DNJ生物合成途径的重组载体和表达β -半乳糖苷酶的出发菌；
[0008] 所述表达DNJ生物合成途径的重组载体按照包括如下步骤的方法获得：将3个 DNJ合成基因共同插入表达载体中，得到表达DNJ生物合成途径的重组载体；
[0009] 所述3个DNJ合成基因为gabTl基因、yktcl基因和gutBl基因；
[0010] 所述表达β -半乳糖苷酶的出发菌按照包括如下步骤的方法获得：将表达β -半 乳糖苷酶的基因整合到大肠杆菌染色体上，得到表达β-半乳糖苷酶的出发菌；
[0011] 2)针对任一个所述DNJ合成基因设计易错PCR扩增引物，并以所述重组载体为模 板，进行易错PCR扩增，得到相应DNJ合成基因的易错PCR产物；
[0012] 3)以所述相应DNJ合成基因的易错PCR产物为引物，所述重组载体为模板，进行 MEGAWHOP PCR，得到MEGAWHOP PCR质粒突变体库；
[0013] 4)将所述MEGAWHOP PCR质粒突变体库转入所述出发菌中，涂平板，得到突变库平 板；且将所述重组载体转入所述出发菌中，涂平板，得到野生菌平板；
[0014] 从所述突变库平板上选取颜色比所述野生菌平板上菌落颜色浅的菌落，即为高产 DNJ 菌；
[0015] 从所述突变库平板上选取颜色比所述野生菌平板上菌落颜色深的菌落，即为低产 或不产DNJ菌；
[0016] 所述高产DNJ菌为DNJ产量高于野生型菌的菌；
[0017] 所述低产或不产DNJ菌为DNJ产量低于野生型菌的菌；
[0018] 所述野生型菌为将所述表达DNJ生物合成途径的重组载体导入所述出发菌中，得 到的菌。
[0019] 所述整合按照包括如下步骤的方法进行：将所述lacS基因通过载体pAH156LACS 导入大肠杆菌中，所述载体PAH156LACS为将lacS基因（序列2)插入载体pAH156获得的 重组载体。
[0020] 上述方法中，步骤1)中，所述DNJ合成基因来源于芽孢杆菌或链霉菌；
[0021] 所述3个DNJ合成基因以含有3个DNJ合成基因的DNA片段的形式插入所述表达 载体中；
[0022] 步骤2)中，所述易错PCR扩增引物为gutBl基因的易错PCR扩增引物。
[0023] 上述方法中，步骤1)中，所述表达载体为pMAL-P2X ;
[0024] 所述含有3个DNJ合成基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列1 ;
[0025] 所述β -半乳糖苷酶的基因的核苷酸序列为序列表中的序列2 ;
[0026] 步骤2)中，所述gutBl基因的易错PCR扩增引物由序列表中序列3所示的单链 DNA分子和序列表中序列4所τκ的单链DNA分子组成。
[0027] 上述方法中，所述大肠杆菌为BW25113。
[0028] 上述方法中，所述方法还包括如下步骤：在步骤4)后重复步骤4)。
[0029] 本发明的另一个目的是提供一种高产DNJ的重组菌。
[0030] 本发明提供的重组菌，为如下1)或2)或3)或4):
[0031] 1)将目的菌的gutBl基因核苷酸序列的第2278位T突变为C得到的菌；
[0032] 2)将目的菌的gutBl基因核苷酸序列的第2895位A突变为G得到的菌；
[0033] 3)将目的菌的gutBl基因核苷酸序列的第3206位G突变为A得到的菌；
[0034] 4)将目的菌的gutBl基因核苷酸序列的第2677位A突变为G得到的菌；
[0035] 所述高产DNJ为高产DNJ的重组菌的DNJ产量高于所述目的菌；
[0036] 所述目的菌为重组菌BW25113LACS/pDNJ5wt，其为将重组载体pDNJ5转入重组菌 BW25113LACS中得到的目的菌；
[0037] 所述重组菌BW25113LACS为将β -半乳糖苷酶的LACS基因同源重组到大肠杆菌 BW25113中得到的重组菌；
[0038] 所述pDNJ5重组载体为将含有gabTl、yktcl和gutBl的片段插入表达载体 PMAL-P2X中得到的重组载体，其中，含有gabTl、yktcl和gutBl的片段的核苷酸序列为序 列表中序列1。
[0039] 本发明的实验证明，本发明利用芽孢杆菌源的DNJ合成基因，基于DNJ对半乳糖苷 酶的抑制活性，利用蓝白斑原理，设计DNJ的高通量筛选方法，通过设计高通量筛选方法对 DNJ进行高效定量检测，可以筛选高产DNJ、低产DNJ或者不产DNJ的菌株，提高到了对于不 同产量DNJ菌株筛选效率，节省时间，简化了筛选步骤。
【附图说明】
[0040] 图1为脱氧野尻霉素结构式
[0041] 图2为解淀粉芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌中DNJ合成途径
[0042] 图3为gutBl基因的易错PCR结果
[0043] 图4为DNJ突变体库的构建
[0044] 图5为DNJ突变体平板复筛
[0045] 图6为DNJ产量的检测
【具体实施方式】
[0046] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0047] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048] 图2为解淀粉芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌中DNJ合成途径
[0049] 实施例1、高通量筛选（或鉴定）高产脱氧野尻霉素（DNJ)菌株的方法
[0050] 一、筛选高产DNJ的菌株
[0051] DNJ合成基因为gabTl、yktcl和gutBl (TYB)，根据基因序列设计引物对1 (DNJ-fo r-Ndel:5'-ATACATATGGGGACGAAGGAAATTACAAA-3'，DNJ-rev-SacI:5'-ATATGAGCTCTTACACCA GCTTCGGATCAGATAC-3'）可以用来扩增这三个基因。
[0052] 1、合成DNJ基因的获得
[0053] 提取萎缩芽孢杆菌ACCC 02297 (中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC 02297) 基因组DNA，用引物对1进行PCR扩增，得到3237bp的PCR产物，为含有gabTl、yktcl和 gutBl的片段（gabTl基因在序列1自5'末端第1-1269位核苷酸，yktcl基因在序列1自 5'末端第1266-2216位核苷酸，gutBl基因在序列1自5'末端第2191-3237位核苷酸）。
[0054] 2、重组载体的构建
[0055] 将上述含有gabTl、yktcl和gutBl的片段经过Ndel和SacI酶切，与经过同样酶 切的表达载体PMAL-P2X (购自NEB#E8000S)连接，得到重组载体pDNJ5。
[0056] 3、易错PCR扩增产物的获得
[0057] 为了提高DNJ活性，合成DNJ所必须的三个酶基因进行易错PCR突变库的构建；
[0058] 以突变gutBl基因的引物为例：引物对2(GutB-For : CGTAAGTTATTGGAGGATATAAAGTGA (序列 3)，GutB-rev :CTCTACATAT TCAAGITTGT CGTTA (序列 4))；
[0059] gutBl基因的突变：以重组载体pDNJ5为模板，用引物对2进行易错PCR扩增收集 1047bp PCR 产物。
[0060] 经0. 8%琼脂糖凝胶电泳分析检测，结果如图3所示，泳道1可见约lkb的特异性 条带，与预期基因大小一致。
[0061] 经过测序，得到的PCR产物为gutBl发生突变，且突变率达到1-4个碱基/kb。
[0062] 上述易错PCR扩增的反应体系和反应程序如下：
[0065] 表 2 为
[0063] 表1为易错PCR扩增的反应体系[0064]
[0066]
[0067]
[0068] 4、MEGAWH0P PCR突变体库的构建
[0069] 将上述3得到的易错PCR产物进行胶回收作为大引物，以所提取的质粒pDNJ5为 模板随后进行megawhop PCR，得到PCR产物（野生型质粒和突变质粒的混合物）。
[0070] 反应体系及反应参数如下表3和表4 :
[0071] 表3为MEGAWHOP PCR突变体库的构建的反应体系
[0072]
[0073] 表 4 为
[0074]
[0075] 随后向上述PCR产物中加入1 μ 1的Dpnl酶切lh用于去除野生型质粒pDNJ5,然 后在80°C作用20min将酶进行失活，得到MEGAWHOP PCR质粒突变体库（突变质粒的混合