蛋白AqpSS9作为水通道蛋白的应用及利用无细胞蛋白合成体系合成并纯化活性蛋白 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型水通道蛋白AqpSS9及其应用，更具体地说，涉及一种通过在 无细胞体系中添加去污剂表达可溶性水通道蛋白，并进一步通过纯化获得水通道蛋白 AqpSS9的方法，并确证AqpSS9具有水通道蛋白的透水功能，同时利用AqpSS9构建了具有透 水活性的仿生膜。
【背景技术】
[0002] 随着世界范围内淡水及能源日益短缺，愈来愈多地关注海水及半咸水的淡化。使 用诸多技术，诸如多效蒸馏(multi-effect distillation，MED)、多级闪蒸(multistage flash，MSF)及蒸汽压缩以及膜淡化（如逆渗透（reverse osmosis，R0)或纳米过滤 (nanof i 1 tration，NF))。生物膜展示经由水通道蛋白（AQP)蛋白质跨渗透压梯度的水输送 特性的最有效方式，其中水通道蛋白结合于磷脂细胞膜中，水可自由通过生物膜而离子却 不能。反渗透膜在应用的过程中需要具有耐压和耐盐的特点，对基于水通道蛋白的反渗透 膜进行改性对其推广应用有重要的意义。
[0003] AqpSS9来源于嗜压菌P.profundum SS9,与大肠杆菌水通道蛋白AqpZ的同源性高 达67%，具有水通道蛋白的标志性功能位点标志性功能位点(NPA)、6个跨膜区域以及5个环 状连接结构，并根据P.profundum SS9的嗜压生理特点推测该蛋白可能属于具有一定抗逆 性的水通道蛋白，即该蛋白可能在对抗高静压力、高盐度等恶劣条件方面将呈现出天然的 优势。开展AqpSS9的性能研究，确证AqpSS9的水通道蛋白功能，既为开发高效、稳定的生物 模拟膜提供了强大的功能蛋白基础，也为揭示深海生物嗜极现象提供了有力的实验证据。 但是缺乏有效手段获得足够量的AqpSS9蛋白样品已成为开展AqpSS9的研究及应用的主要 瓶颈。主要由于AqpSS9蛋白强烈的疏水性，它在细胞内的大量表达会造成细胞毒性，影响宿 主细胞的正常代谢，因此其表达水平受到大大的限制，很难满足结构学研究和制备基于水 通道蛋白的水回收装置的要求。
【发明内容】
[0004] 本发明首先所要解决的技术问题是提供蛋白AqpSS9作为水通道蛋白的应用，蛋白 AqpSS9的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0005] 进一步地，所述作为水通道蛋白的应用为用于制备仿生膜。
[0006] 所获得的水通道蛋白制备仿生膜具有透水性，当仿生膜的水通道蛋白AqpSS9与磷 脂的质量比为〇时水通量为0.4L · πΓ2 · 1Γ1，当仿生膜的水通道蛋白AqpSS9与磷脂的质量比 提高到1/200时水通量上升到2.2L · πΓ2 · 1Γ1，当仿生膜的水通道蛋白AqpSS9与磷脂的质量 比提高到1/50时水通量上升到2.7L · πΓ2 · 1Γ1。所述磷脂由75%的1，2_二油酰基磷脂酰胆 碱和25 %的（2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺构成。
[0007] 编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。
[0008] 蛋白AqpSS9具有透水的功能，空脂质体的水通透因子Pf值为89.3±1.8以111/8，嵌有 AqpSS9的脂蛋白体的Pf值为310 · 7 ± 3 · 2ym/s，AqpSS9的单体水通透因子Pf ,Mn。为1 · 24 X 10 -2V/s。
[0009] 本发明还提供了含上述核苷酸序列的一种表达载体pIVEX-2.4c-AqpSS9,所述表 达质粒pIVEX-2.4c_AqpSS9是利用PCR扩增出AqpSS9基因并克隆到pIVEX_2.4c质粒上构建 的。
[0010]本发明还提供了一种利用无细胞蛋白合成体系合成并纯化活性蛋白AqpSS9的方 法，其特征在于，其无细胞蛋白合成体系具有如下特征，在无细胞蛋白的合成体系中添加去 污剂Bri j-78至0 · 7 %，并加入所述表达载体pIVEX-2 · 4c-AqpSS9至 10μg/ml，37 °C，400rpm反 应4h后可溶性的AqpSS9的产量达到565mg/L。
【附图说明】
[0011] 图1为AqpSS9表达载体pIVEX-2.4c-AqpSS9的结构示意图。
[0012]图2显示了在不同去污剂存在的无细胞合成体系中可溶性AqpSS9的表达。 "control"表示不含去污剂的样品，"P"表示沉淀；"S"表示上清
[0013]图3显示了在不同浓度的Brij-78存在的无细胞合成体系中可溶性AqpSS9的表达。 "control"表示不含去污剂的样品，"P"表示沉淀；"S"表示上清
[0014]图4显示了AqpSS9的透水活性。"D0PC"表示由1，2_二油酰基磷脂酰胆碱制备的脂 质体。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合几个实施例对本发明提供的利用无细胞蛋白合成体系合成并纯化活性 水通道蛋白AqpSS9的方法作进一步说明。
[0016] 实例lAqpSS9表达载体的构建
[0017] 水通道蛋白AqpSS9的基因为aqpSS9，aqpSS9的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，来 自于模式菌株P.profuncum SS9。根据aqpSS9的序列设ir| 对引物：Primerl:5'_ G CC T C G A GCGATGTCAGTTATCACACCATATC-3 ' 和Primer2 : 5 ' -CGGGATCCTTATTAATGATGATGATGATGATGATCTTCGTTTGGACACAACC~3,。Primer 1 带有Xhol酶切位 点，Pr imer2带有BamHl酶切位点并引入了 6个组氨酸标签。利用聚合酶链式反应，得到带有 组氨酸标签水通道蛋白AqpZ-HIS的DNAWCR产物用试剂盒回收，用Xhol和BamHI双酶切 PIVEX2.4c质粒和PCR产物，割胶回收，用T4DNA连接酶16°C连接过夜，再用DH5a感受态细胞 转化，涂布Amp抗性平板，最后对阳性克隆进行转接、提质粒和双酶切验证，并经测序进一步 确证。所构建的载体的结构示意图如图1所示。
[0018] 实例2无细胞蛋白合成体系制备
[0019] 2.1大肠杆菌无细胞表达体系的配方如表1所示
[0020] 表1大肠杆菌无细胞表达体系配制
[0021]
[0022]
[0023] 2.2 Energy Mix(3.2X )的配制
[0024] 2.1中所述的Energy Mix(3.2X)的配制见表2:NTPs包含30mM ATP和各20mM CTP、 GTP 及 UTP(GTP/CTP/UTP 的终浓度为 0 · 8mM)
[0025] 表2 Energy Mix(3.2X )的配制
[0026]
[0027] 表2中所述Energy Mix( 10 X )的配制见表3
[0028] 表3 Energy Mix(10X )的配制
[0029]
[0030]
[0031] 2.3 E.coli(BL21)抽提物的制备
[0032] 2 · 1所述的E · co 1 i (BL21)抽提物的制备方法如下：
[0033] (1)将大肠杆菌BL21(DE3)菌株从新鲜平板上接入100mL摇瓶(无细胞发酵培养基 见2.1.4)中，在37°(：，200印111的摇床中培养过夜。
[0034] (2)按2%接种量把种子液转接到500mL的摇瓶中，在37°C，200rpm的摇床中培养至 OD60Q 在 1.5-2之间。
[0035] (3)4°C，6,000g离心30min，收集菌体
[0036] (4)用预冷的Bufferl(10mM Tris-OAc pH 8.2,60mM K0Ac，14mM Mg(0Ac)2，lmM DTT，7πιΜβ-巯基乙醇）重悬菌体，充分摇匀(每g菌体需16 · 6mL Buff er 1)。
[0037] (5)4°C，5，OOOg离心20min，收集菌体，弃掉上清。
[0038] (6)重复(4)，（5)两步（其中每g菌体加入6.6mL Bufferl)。
[0039] (7)用预冷的Buffer2(10mM Tris-OAc pH 8.2,60mM K0Ac，14mM Mg(0Ac)2，lmM DTT)重悬菌体，充分摇勾(每g菌体需1.3mL Buffer2)。
[0040] (8)在高压破碎仪中以1000ps i的压力破碎菌体两次。
[00411 (9)将破胞液以30,000g的速度离心30min(4°C)，把上清液转移至新的离心管中， 再次以30,00(^的速度离心3011^11(4°(：)。
[0042] (10)将上清液转移至新的离心管中，每10m