N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶AiiO的高效生产方法及检测的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程与发酵工程领域，具体地涉及N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶Ai1的高效生产方法及检测。
【背景技术】
[0002]细菌中存在群体感应(quorumsensing，QS)调节系统，细菌能够分泌特定的信号分子并感应其浓度，当信号分子达到一定阈值时，能够与信号分子受体蛋白相结合，进而启动群体感应通路下游多种基因的表达，使菌体适应环境中的变化。革兰氏阴性细菌中典型的一类信号分子为N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones，AHL)，AHL介导的QS系统被证实参与多项细菌生物学功能的调控，包括生物发光、抗生素的合成、群集、生物膜的形成和毒力因子的产生等。
[0003]由于多种革兰氏阴性病原细菌的致病性均受QS系统的调控，因此，通过降解AHL实现群体感应猝灭，能够有效干扰病原菌QS系统，破坏其参与调控的毒力基因表达，该方法有望成为一种新型的微生物病害防治策略。研究发现，细菌能够产生群体感应猝灭酶，主要包括酰基高丝氨酸内酯酶和AHL酰基转移酶。其中，AHL酰基转移酶能够作用于AHL中与内酯环相连的酰基侧链，切断酰胺键，使信号分子失去活性。该类酶的合成与生产对于开发新型的病原菌防治药物具有重要意义。目前的研究主要集中于酰基高丝氨酸内酯酶的酶学性质及应用[1?2]对于AHL酰基转移酶的高效发酵生产及检测则鲜有报道。
【发明内容】
[0004]为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶Ai1的高效生产方法及检测方法。本发明通过构建一种能够表达AHL酰基转移酶的基因重组菌，对该酰基转移酶利用本发明的复合自诱导培养基及变温分批发酵方式进行发酵罐水平的高效发酵，得到高酶活力的发酵液及高比活力的AHL酰基转移酶;利用Quantity one软件对蛋白定量分析，以已知浓度的纯化样品作为定量依据，能够快速地对发酵过程不同时间细胞内AHL酰基转移酶总浓度进行准确定量；同时本发明还构建了专用于该酶活力检测的体系，实现准确快速检测酶活力的目的。为解决上述问题，本发明采用以下技术方案，N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶Ai1的高效生产方法及检测包括以下步骤:
[0005]S1:构建含ai1基因的重组表达载体；
[0006]S2:将重组表达载体转化大肠埃希氏菌得到重组菌；
[0007]S3:利用重组菌进行发酵罐高密度发酵，培养过程中采用复合自诱导培养基，获得重组蛋SAi1;利用Quantity One软件，测定发酵过程中不同时间细胞内Ai1全蛋白表达量；
[0008]S4:利用镍亲和层析对重组蛋白Ai 1进行纯化；
[0009]S5:建立酶活力测定体系，用反相高效液相色谱测定AHL酰基转移酶活力；
[0010]高密度增殖培养基组成为:Na2HP042?5g/L，KH2P042?5g/L，NH4Cl2?4g/L，Na2S040.5?lg/L，MgS04.7H20 0.3?0.8g/L，FeCl3.6H2O 0.0l?0.05g/L，葡萄糖4?6g/L，六水琥珀酸钠2?4g/L，二水柠檬酸钠0.2?0.4g/L ；
[0011 ] 复合自诱导培养基组成为:蛋白胨10?20g/L，酵母粉5?10g/L，Na2HP042?5g/L，KH2PO42?5g/L，NH4Cl 2?4g/L，Na2S040.5?lg/L，MgS04.7H20 0.3?0.8g/L，FeCl3.6H2O0.01?0.05g/L，甘油4?25mL，葡萄糖0.3?lg/L，a-乳糖I?3g/L，六水琥泊酸钠3?8g/L，二水柠檬酸钠0.2?0.4g/L。
[0012]进一步的，所述步骤SI具体为:将小麦苍白杆菌接菌至LB培养基中，30°C培养12h，提取基因组，PCR扩增ai1;用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切纯化后的PCR扩增产物和载体pET-28a( + )，将酶切产物和载体骨架连接。
[0013]进一步的，所述步骤S2具体为:将步骤SI得到的连接产物热击转化大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞，经培养及鉴定得到重组菌。
[0014]进一步的，所述步骤S3具体为:将重组菌接种于高密度增殖液体培养基中，37°C，220rpm振摇培养过夜;取重组菌过夜培养液，以1%。接种于复合自诱导培养基中，发酵罐装液量为总容积的60%?75%，转速300?500rpm，通气量3?4L/min，以二甲基硅油为消泡剂，消泡剂用量为0.3%。AD6qq达到0.8?1.0，将发酵温度降低至25?30°C。控制相对溶氧20%?30%左右，通过发酵获得重组蛋白Ai1。利用Quantity one软件分析SDS-PAGE电泳胶中蛋白电泳条带的光密度值，以分子筛纯化蛋白的上样量为参照，对发酵过程中不同时间的全蛋白表达量进行定量。
[0015]作为本发明一个优选的实施例，所述的高密度增殖培养基组成为:Na2HP043.55g/L,KH2P043.4g/L, NH4Cl 2.68g/L ,Na2SO40.71g/L,MgS04.7H20 0.49g/L ,FeCl3.6H2O0.027g/L，葡萄糖5g/L，六水琥?自酸钠2.5g/L，二水梓檬酸钠0.3g/L。
[0016]作为本发明一个优选的实施例，所述的复合自诱导培养基组成为:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na2HP043.55g/L，KH2P043.4g/L，NH4Cl 2.68g/L, Na2SO40.71 g/L, MgSO4.7H200.49g/L,FeCl3.6H2O 0.027g/L，甘油 20ml，葡萄糖 0.5g/L，α-乳糖 2g/L，六水琥珀酸钠5.4g/L，二水柠檬酸钠0.3g/L0
[0017]进一步的，本发明构建的酶活力测定体系:信号分子C6-HSL溶液与Ai1蛋白的质量浓度比为99.625:1，缓冲液为10011111101/1 Tris-HCl溶液，pH 7.0。反应条件为30°C反应15min，用反应体系总体积10 %的乙腈终止反应。紫外检测波长为190nm，流动相:乙腈/水(30/70);流速:0.5mL/min。
[0018]采用本发明的复合自诱导培养基及变温分批发酵方式进行发酵培养，其中利用乳糖诱导代替常规的IPTG诱导手段进行异源蛋白表达，发酵温度由37°C降低至25°C，可高效表达一种新型的AHL酰基转移酶，酶比活力高达19.24±3.71U/mg，按发酵罐发酵并纯化后得到AHL酰基转移酶计算，酶活力为2.62U/mL发酵液。由于本发明中对酶活力的定义与张美超等人[3]不同，张美超等人对酶活力定义为在30°C下Imin分解Inmol信号分子所需的酶量被定义为一个酶活单位。因此，按其提出的酶活力单位进行推算，本发明得到的AHL酰基转移酶的比活力约为其33倍。本发明中，在发酵罐中经乳糖诱导得到的发酵液的酶活力是摇瓶中经IPTG诱导得到的发酵液酶活力的7.6倍。
[0019]利用本发明中应用Quantityone软件对蛋白定量分析的方法，以已知浓度的纯化样品作为定量依据，能够快速地对发酵过程不同时间的AHL酰基转移酶(细胞全蛋白)浓度进行准确定量，而现有技术中并没有能够对发酵过程不同时间的AHL酰基转移酶(细胞全蛋白)浓度进行定量的方法。
[0020]利用本发明提供的酶活力测定方法及建立的酶活力测定用反应体系，可以比周志刚等人[4]的同类酶活力测定方法更为准确快速地测定AHL酰基转移酶的活力。列举文献中的方法需要多于24h的检测时间才能测定酶活力，而本发明仅需要酶与底物反应15min，进而利用高效液相色谱分析15min，即可测定酶活力。
[0021 ]本发明可以降低AHL酰基转移酶的生产成本，实现AHL酰基转移酶的高效生产，同时对发酵过程中AHL酰基转移酶的浓度及纯化后AHL酰基转移酶的酶活力进行准确快速的测定，该酶可作为一种新型的病害防治酶制剂使用。
【附图说明】
[0022]图1为ai1基因的PCR扩增；其中，M:DNAmarker DL2000;泳道1:aii0基因；
[0023]图2转化后菌落质粒提取的电泳检测；其中，M:Supercoiled DNA Marker;泳道1:质粒pET-28a ；泳道2?3:提取质粒；
[0024]图3质粒双酶切后电泳检测；其中，M:DNA marker DL10000 ;泳道1:质粒pET28a_ai1双酶切；
[0025]图4 Ai1蛋白纯化总图；其中，M:Blue Plus Π Protein Marker; 1:未诱导全蛋白；2:诱导全蛋白；3:诱导破碎前上清;4:诱导破碎后沉淀；5:诱导破碎后上清;6:镍柱纯化;7:酶切后;8:分子筛纯化；
[0026]图5全蛋白检测电泳图；其中，M:Blue Plus Π Protein Marker; 1:4h全蛋白；2:8h全蛋白；3:12h全蛋白；4:16h全蛋白；5:20h全蛋白；6:24h全蛋白；7:分子筛纯化样品；
[0027]图6发酵过程分析;其中，.-0D600;V_Ai 1全蛋白浓度；▲-甘油浓度；〇-pH;
[0028]图7 Ai 1蛋白的活性检测；其中，A:紫色视杆菌CV026+AHL ； B:紫色视杆菌CV026+AHL+Ai1蛋白纯化溶液；
[0029]图8 C6-HSL与Ai1、灭活的Ai1反应15min的色谱图；其中A为lmmol/L C6-HSL与2yg/mL灭活的Ai1反应15min的色谱图；13为lmmol/L C6-HSL与2yg/mLAii0反应15min的色谱图；图中，1、2: Tris-HCl溶液峰;3:信号分子C6-HSL峰。
【具体实施方式】
[0030]以下的实施例便于更好地