一种spl18基因在提高植物产量中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种SPL18基因的应用，特别是在水稻、玉米和小麦等作物上用来调控 农作物单穗粒数和粒重以及提高产量的应用。 (二)
【背景技术】
[0002] 人口的不断增加和可耕种面积的减少，必须依靠提高农作物单位面积产量才能满 足人类的需求。转基因技术已经被广泛用来改良农作物的性状，如获得抗虫能力、抗除草剂 能力、增强抗干旱、抗病能力等。高产也是转基因农作物改良的重要内容。例如，利用转基因 表达一种植物的转录因子（Transcription factor)可以提高农作物的产量 (U. S. Pat. No. 7，598，529，4)。但是，农作物产量是一个复杂的数量性状，受到很多基因的调 控（Xing and Zhang, (2010)Annual Review of Plant Biology ,61:421-442)。研究和发掘 更多有重大应用价值的新基因，并利用这些基因提高农作物产量是目前农作物研究的重中 之重。
[0003] "绿色革命"中，矮杆化提高了作物的抗倒伏性和收获指数，通过合理密植和肥料 的大量使用，使得农作物，特别是水稻和小麦的产量大幅提高(Monna et al.，（2002)DNA Research,9(1):11-17；Sasaki et al.,(2002)Nature,416(6882):701-702；Spielmeyer, (2002) Sci ences，99 (13): 9043-9048)。近年来，随着收获指数逐渐接近瓶颈值，育种家在水 稻上提出了理想株型（Ideal Plant Architecture)的概念。理想株型的主要性质包括分蘖 数适中且无效分蘖少，单穗粒数增加，莖干更厚更结实(Khush，G. S.，（1995)Geo journal， 35:329-332)。因此，研究作物的穗粒数的调控机制，分离出关键基因并应用到作物培育中， 是获得高产作物的重要途径。
[0004] SQUAMOSA(SQUA)promoter-binding-like(SPL)基因是在植株生长发育过程中起 关键作用的一类转录因子。SPLs是植物特有，具有一个保属的大小约为78个氨基酸的SBP (SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN)结构域。这个结构域包含3个重要的功能基序，即 锌指l(Znl)、锌指2(Zn2)和核定位信号（NLS)(Yamasaki et al.，（2004)Journal of Molecular Biology,337(1):49-63；Birkenbihl et al.,(2005)Journal of Molecular Biology,352(3):585-596；Preston and Hileman,(2013)Frontiers in Plant Science 4)。目前，在大多数植物中都发现了多个SPL基因，其中拟南芥、水稻、小立碗藓、玉米、番茄 和杨树中分别含有 16，19，13,31，15和28个(1^&11(11^，（2014)81?：?1&1^81〇1(^7 14)·。
[0005] 目前，对AtSPL基因已经展开了很多研究，很多基因的功能及其调控机理也已经清 楚。拟南芥中的16个SPL基因分别被命名为A t SPL 1 -A t SPL 16。其中A t SPL 1，A t SPL7，A t SPL 12， AtSPL14和AtSPL16编码的蛋白的分子量相对较大，且为组成型表达；另外的编码的蛋白分 子量相对较小，且主要在花器官中表达（Cardon et al.，（1999)Gene，237(l):91-104)。 AtSPL基因中大多数基因的表达都受MIR156家族的miRNAs调控。在这些基因中，AtSPL3， AtSPL4和AtSPL5,能促进营养生长期转换和开花（Cardon et al.，（1997)Plant Journal, 12(2):367-377；Gandikota et al.,(2007)Plant Journa,! 49(4):683-693)〇AtSPL2, AtSPL 和 AtSPLll 调控茎生叶和花的表型（Shikata et al.，（2009)Plant and Cell Physiology ,50(12) :2133-2145) jtSPLg和AtSPL15类似，都具有调控植株从幼苗生长期到 成熟生长期转换和叶片生长速率的功能（Schwarz et al.，（2008)Plant Molecular Biology ,67(卜2) : 183-195.)。另外，六个AtSPL基因，包括AtSPLl，AtSPL7，AtSPL8， AtSPL12，AtSPL14和AtSPL16,不是miR156的靶标基因。其中，AtSPL7能直接和铜反应元件 (CuRE)结合，调控拟南芥中铜离子的动态平衡（Yamasaki et al.，（2009)Plant Cell ,21 (1) :347-361) jtSPLS参与调控花粉囊的发育、雄性育性和GA的生物合成和信号转导 (Zhang et al.，（2〇〇7)Plant Molecular Biology，63(3):429-439)<^七5卩1^ 4在植物发育 和对伏马菌素 B1的敏感度中起到关键作用（Stone et al.，（2005)Plant Journal ,41(5): 744-754)〇
[0006] 近年来，水稻中的OsSPL基因的功能研究也取得了很多重要进展。0sSPL14调控水 稻分蘖和单穗粒数，0sSPL14高表达能减少无效分蘖，促进穗分支，增加单穗粒数，提高谷粒 产量（Jiao et al.，（2010)Nature Genetics，42(6):541_544;Miura et al. ,(2010) Nature Genetics ,42(6): 545-549)。进一步研究表明，0sSPL14可能是通过和反向调控分蘖 芽生长的TE0SINTE BRANCHED1基因的启动子直接结合，来抑制分蘖;通过直接和正向调控 一个穗形态的重要调控基因 DENSE AND ERECT PANICLE1，来影响株高和穗长(Lu et al.， (2013)Plant Cell ,25( 10) :3743-3759)。〇85?1^16(即GW8)蛋白正向调控细胞分裂，在水稻 中过表达该基因促进细胞分裂和灌浆，使得种子变宽切谷物产量增加 （Wang et al.， (2012)Nature Genetics 44(8) :950-954) AW7是另外一个促进谷粒变得细长的基因， 0sSPL16通过和GW7的启动子结合抑制其表达来调控谷粒宽度(Wang et al.，（2015)Nature Genetics 47(8) :949-954)。但是，水稻中还有很多OsSPL基因的功能未知，更为深入和全面 的研究这些SPL基因对发掘更多产量性状调控基因和培育高产作物都非常重要。 (三)
【发明内容】
[0007] 本发明目的是通过调控一种SPL18基因的表达，减少水稻无效分蘖，促进穗分支， 单穗谷粒数增加且产量增加。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明提供一种SPL18基因在提高植物产量中的应用，所述的应用是将SPL18基因 与表达元件连接构建表达框，然后将表达框导入植物中，减少无效分蘖，促进穗分支，增加 单穗粒数，实现植物增产;所述表达元件包括启动子、增强子和终止子;具体优选方法为:将 SPL18基因、启动子和终止子进行功能性连接，获得一个能够在植物中表达的SPL18基因表 达框，然后通过植物转化的方法将SPL18基因表达框导入植物的基因组中使之表达，从而实 现植物高产，获得谷物产量提高的改良转基因植物。改良的转基因植物是指与非转基因的 亲本植物相比，单穗粒数、产量至少增加3%。
[0010] 本发明提供的SPL18基因可以是来自任何植物，优选自禾本科植物(单子叶植物或 双子叶植物），比如来自玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、黑麦、小米、大豆、油菜或向日葵，特别 优选来自水稻、玉米或大豆。一般可以预见这些来自不同植物的同源蛋白具有相同或者相 似的功能，因此同样可以利用这些基因改良植物的农艺性状。进一步，即使不能预见这些蛋 白的功能，本领域的一般技术人员可以根据本发明提供的方法和现有技术测定它们是否具 有促进植物提早成熟的功能。
[0011]本发明所述的SPL18为具有一个保属的大小约为78个氨基酸的SBP(SQUAM0SA PROMOTER BINDING PROTEIN)结构域的转录因子。本发明所述的SPL18基因包含的SBP结构 域的氨基酸序列如SEQ ID N0:1或者具有与其至少92.5%的序列一致性氨基酸序列。本发 明最优选SPL基因为下列来源之一的基因或下列任一序列的同源序列，其编码的SPL为下列 氨基酸序列之一或具有下列任一序列58%或70%或80%或90%以上同源性的序列：水稻 (Oryza sativa)中籼稻的0sSPL18基因（氨基酸序列为SEQ ID N0:2所示，核苷酸序列为SEQ ID N0:6所示）；粳稻的0sSPL18基因（氨基酸序列为SEQ ID N0:3所示，核苷酸序列为SEQ ID N0:7所示）；玉米(ZeamaiZe)的ZmSPL18基因（氨基酸序列为SEQIDN0 :4所示，核苷酸序列 为SEQ ID NO:8所示）。
[0012]编码本发明SPL18基因的多核苷酸序列可以有多种不同的变异，多核苷酸序列的 变异包括但不限于：1)由于编码同一个氨基酸的密码子不同而获得不同的多核苷酸序列， 这些序列编码具有相同活性的蛋白质多肽；2)来源于生物的遗传多态性（Genetic Polymorphism)，即同一种植物的不同个体或者群体之间的多样性;3)通过人工操作导入多 核苷酸序列的变异。人工导入的这种变异可以是随机的变异，也可以是针对性的定向变异。 本领域的一般技术人员就能通过分子生物学的方法产生点突变，插入或者缺失变异等。通 过人工操作导入多核苷酸序列的变异也包括通过Gene Shuffling等方法获得仍然具有正 常功能的杂合基因。例如 U.S.Pat.No.2002/0058249;Stemmer(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:10747-10751;Stemmer(1994)Nature，370:389-391;Crameri et al.(1997)Nature Biotech.,15:436-438；Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.,272:336-347；Zhang et al.(1997)Proc. Natl. Acad.Sci. USA,94:4504-4509