一种建立cyp2d1基因敲除大鼠模型的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种建立CYP2D1基因敲除大鼠模型的方法，属于转基因技术领域。
【背景技术】
[0002] 细胞色素 P450 (cytochrome P450 )，又称混合功能氧化酶（mixed-function oxidase)或单加氧酶(monooxygenase)，主要存在于肝微粒体中，在内源性物质和包括药 物、环境化合物在内的外源性物质的生物转化中起着关键的作用。P450是药物代谢的第I相 酶，它的活性对药物的代谢和毒性产物的生成往往起着决定性作用。人体内约有75%的药 物通过 CYP 代谢。人体内 CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1 和 CYP3A4 与 95% 现有临床 药物的代谢相关，而与大鼠相对应的CYP1A2，CYP2D1，CYP2C13，CYP2D2，CYP2E1和CYP3A1同 工酶是当两种或两种以上药物联合应用时，由于药物之间的相互作用而使药效或不良反应 加强或减轻，甚至出现未预期的不良反应。因此，对该酶系的研究一直是药物代谢和毒理学 中的热点领域。
[0003] 尽管P450基因敲除小鼠模型的建立和应用已经取得了初步成功，但在实际的操作 过程中一直存在两个主要困难，一是在临床前药物安全性评价工作中，常规的手段包括基 于大鼠肝微粒体的体外试验、基于大鼠的各类毒性试验和药代动力学试验，如何把这些大 鼠的数据与基因敲除小鼠模型的实验数据加以整合，需要操作者对不同物种的P450酶系具 有深入的理论认识和长期的实践经验，这一困难在相当程度上制约了 P450基因敲除小鼠模 型的使用和推广；二是小鼠模型受限于其物种，存在可检测组织体积小，体液容量小等特 点，这对后续的药代动力学和毒理学试验提出了更高的技术要求。因此建立P450基因敲除 大鼠模型，将切实解决上述两个困难。
[0004] 人类CYP2D6基因位于22号常染色体上，尽管它的表达量只占人类肝脏总P450的 4%，但却与大约30%常用药物的生物转化相关。CYP2D6的底物包括多种抗心律失常药、受体 阻滞药、抗高血压药、镇痛药、抗精神病药以及三环类抗抑郁药等。高加索人种中大约有6%-10%属于CYP2D6慢代谢者，亚洲人种约为2%。在大鼠中，CYP2D亚家族包括6个亚型，其中已明 确大鼠 CYP2D1为人类CYP2D6的直系同源基因。所以，CYP2D1基因敲除大鼠模型缺乏人类 CYP2D6相类似的代谢能力，将较好的模拟CYP2D6慢代谢人群，验证候选药物针对该人群的 安全性。
[0005] 锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶 (Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)分别通过锌指蛋白 (Zinc finger protein，ZNP)和类转录激活因子效应物（Transcription activator-like effector)识别DNA序列，并在特定位点对DNA进行切割，形成双链断裂 (Double strand breaks DSB)，随后在非同源末端连接（Non homologous end joining， NHEJ)修复机制下形成随机的多个碱基的插入或删除，从而实现基因敲除;或者在同源重组 (Homologous recombination，HR)修复机制以及修复模板(donor)存在的条件下，实现定点 的单个碱基或者长片段的插入、删除或者突变。此外，利用TALEN和特定的转录因子或者抑 制因子结合，还可以实现对内源基因特异性的转录激活或者抑制、操纵内源基因的表达。目 前TALEN技术的靶位点已经覆盖了多个物种的全基因组，实现了真正意义上的全基因组操 作。ZFN和TALEN技术不仅极大地提高了基因打靶的效率，而且更高效地实现了对基因组的 定点操作以及基因表达控制，如定点插入、删除和替换、转录抑制或激活等，真正的在应用 水平实现了对动植物基因组的精细操作，因此也将以ZFN和TALEN为代表的技术统称为基因 组编辑(Genome editing)技术。
[0006] CRISPR是指成族的、规律的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) <XRISPR-CAS9系统主要是由三个部分组成，分别是Cas9蛋 白、precursor CRISPR RNA (pre-crRNA)和 trans-activating crRNA (tracrRNA)， CRISPR-CAS9识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-Strand breaks，DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接（Non-homologousend joining，NHEJ)，造成移码突变（frame shift mutation)，导致基因敲除（刘志国，CRISPR-CAS9系统介导基因组编辑的研究进展，畜牧兽医学报，2014-45( 10) : 167-1583)。
[0007] 与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体， 而且可以在不同的位点同时引入多个突变。从质粒构建上来看，CRISPR-CAS9技术设计简 单，操作简便，节约成本。CRISPR-CAS9系统设计过程中只需改变勒基因 SgRNA的20个碱基组 成的向导序列即可，一步简单的分子克隆即可完成。CRISPR/Cas9技术的发展十分迅猛，已 经广泛应用在动物的细胞水平、植物、微生物以及人类医学等各方面。但是CRISPR-CAS9系 统目前也面临着脱靶率高、特异性差的难题，这无疑是CRISPR/Cas9系统应用于基础研究和 临床治疗的最大的挑战。
【发明内容】
[0008] 本发明旨在提供一种CRISPR/cas9基因敲除的CYP2D1大鼠模型。
[0009]另一个方面，本发明提供了一种基于CRISPR/cas9基因敲除技术建立CYP2D1基因 大鼠动物模型的方法，包括以下步骤： (1)确定CYP2D 1大鼠待敲除基因的特异性靶位点sgRNA 1，sgRNA2，sgRNA3 :使用Gene Knock-Out with Cas9软件（南京徇齐生物技术有限公司提供），确定在CYP2D1基因 （Gene ID: 266684)的靶位点exon4内挑选3个特异性的sgRNA靶序列，这两个靶序列分别为:sgRNAl (SEQ. ID. NO.1)：CAGCATGGCCTTGGGATTGA,sgRNA2(SEQ. ID. NO.2)：AGACCCTTACCTCATCAGGA； sgRNA3(SEQ.ID.N0.3):CTAGTTTCACCATCCTGATG<XYP2Dl 基因长度为 586bp。
[0010] (2)根据步骤（l)sgRNA靶序列，设计3对引物（南京金斯瑞生物有限公司）：Rat_ CYP2Dl_c9_l-01(SEQ. ID. NO.4)：cacc CAGCATGGCCTTGGGATTGA 和Rat_CYP2Dl_c9_l-02(SEQ·ID·NO·5):aaac TCAATCCCAAGGCCATGCTG;Rat_CYP2D1_ c9_2-01(SEQ. ID. NO.6):cacc AGACCCTTACCTCATCAGGA 和Rat_CYP2Dl_c9_2-02(SEQ·ID·NO·7):aaac TCCTGATGAGGTAAGGGTCT;Rat_CYP2D1_ c9_3-01(SEQ. ID. NO.8)：cacc CTAGTTTCACCATCCTGATG 和Rat_CYP2Dl_c9_3-02(SEQ·ID·N0·9):aaacCATCAGGATGGTGAAACTAG， (3)将步骤(2)中合成的3对引物以逐步降温(94°C_55°C)的方法退火成双链，插入经 Bsal酶切好的Cas9-gRNA-Bsal载体中。载体DNA测出浓度为lOOOng/yL，测序验证插入片段 正确，将正确的克隆用作转录模板。
[0011] (4)将步骤（3)正确的克隆作为PCR模板，通过PCR得到带有T7启动子序列的 sgRNAl，sgRNA2，sgRNA3。用T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit 试剂盒体外转录带 有T7启动子的SgRNAl，sgRNA2，sgRNA3。酚氯仿萃取和酒精沉降法纯化转录产物。
[0012] (5)Cas9载体体外转录为Cas9 mRNA并进行纯化：使用T7 Ultra Kit (Ambion, AM1345)试剂盒，将pST1374-cas9载体经Agel线性化后，在体外转录成Cas9 mRNA。用RNeasy Mini Kit (Qiagen, 74104)试剂盒纯化Cas9 mRNA。