一种中国被毛孢发酵滤液的回收利用方法
【专利说明】
(一)
技术领域
[0001]本发明涉及冬虫夏草生产菌中国被毛孢的发酵滤液的回收利用方法以及电渗析后滤液的循环应用。
(二)
【背景技术】
[0002]冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍贵的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。
[0003]上世纪八十年代，本发明人之一的杭州中美华东制药有限公司完成人工生产冬虫夏草的研究，即将冬虫夏草的产生菌中国被毛孢进行微生物液体发酵培养，并且利用菌丝体经干燥制成药品一一“百令”胶囊(批准文号:国药准字Z10910036)，能够部分地替代野生冬虫夏草的功能，已经在临床上使用广泛并取得肯定的疗效。
[0004]在业内，考虑到生产成本，没有对中国被毛孢的发酵滤液和其中有效成分进行研究，发酵滤液一般被当成废水处理。由于发酵滤液中含有少量的重金属离子等容易造成环境污染的物质，若直接当废水排放会对环境造成一定的危害，因此必须经过废水处理达到行业废水排放标准后直接排放。废水处理将产生不菲的费用，目前处理一吨中国被毛孢的发酵滤液，仅能耗成本就超过5元，而I吨自来水的工业成本也高于6元；同时浪费了发酵滤液中含有的大量的有用资源，如微量元素等。
[0005]发酵滤液的处理方法一般有物理处理法、化学处理法和生物处理法。物理处理法采用沉淀、过滤、离心分离、气浮、蒸发结晶、反渗透等方法，化学处理法有中和、混凝、氧化还原、萃取、汽提、吹脱、吸附、离子交换以及电渗透等，而生物处理法有活性污泥法、生物滤池和氧化塘等，物理和化学处理法具有步骤繁琐和成本高的缺点，利用生物处理法不仅成本低而且环保。
[0006]电渗析属于物理方法，一般用于海水的淡化、物料浓缩等。工业上利用电渗析脱盐原理，对生产废水进行处理并回用。Yu-Mei Chao等对电渗析技术用于工业废水回用处理进行了技术和经济上的可行性研究(Chao Y M ,Liang T M.A feasibility study ofindustrial wastewater recovery using electrodialysis reversal[J].Desalinat1n.2008,221 (I):433-439.) (ref)。!\ Sirivedhin等利用电渗析脱除生产废水中的盐分，力图达到饮用水、灌溉用水及牲畜饮水标准(Sirivedhin T1Mccue J,Dallbauman L.Reclaiming produced water for beneficial use: salt removal byelectrodialysis [J].J.Membrane.Sc1.2004,243 (s 1-2): 335-343.)。但一直没有文献报导采用电渗析技术进行发酵滤液的回收利用(ref)。
[0007]众所周知，有的发酵产品包含在发酵滤液中，而有的发酵产品则包含在菌体中，而且经过滤去除菌丝体后的发酵滤液并不一定含有一定量的活性成分，更多的是含有危害的次级代谢产物，不一定具有循环利用的价值。因此目前制药企业都将发酵滤液直接将其当成废水进行处理。另外，电渗析前的发酵滤液预处理(过滤等)需要花费一定的费用，而浓度差的缘故容易使电渗析设备结垢并发生反渗透，导致除盐效率不理想，因此，电渗析很少被制药企业所利用。
(三)
【发明内容】
[0008]本发明目的在于针对以上存在的不足，提供一种“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢深层发酵滤液的再循环利用方法。
[0009]本发明提供了一种中国被毛孢发酵滤液的回收利用方法，所述方法为:以中国被毛孢经发酵培养获得的发酵液过滤后的滤液为进水，采用均相离子交换膜，在进水流量为200-400L/h、运行电压为20-30V的条件下进行电渗析处理，收集电渗析流出液，即为中国被毛孢发酵滤液回收水，回收利用。
[0010]其中所述的电渗析处理，具体的说，电渗析中所用膜为离子交换膜，优选均相离子交换膜，更优选聚乙烯均相离子交换膜，可以采用国产膜。若选用其他膜，如异相离子交换膜，脱盐率较低。比如选用浙江赛特膜技术有限公司提供的I型异相离子交换膜，料液流量为300L/h、运行电压为30V时，处理时间约为30分钟，其脱盐率为85 %。选用浙江赛特膜技术有限公司提供的Π型异相离子交换膜，料液流量400L/h、运行电压为30V时，处理时间约为20分钟，其脱盐率为70 %。
[0011]其中所述的电渗析条件为:进水流量为200-400L/h、运行电压为20-30V、处理时间为18-35分钟。优选进水流量300L/h、运行电压为30V时，处理时间约为20分钟。
[0012]进一步，所述回收利用是将中国被毛孢发酵滤液回收水用于配制微生物培养基，替代蒸馏水、自来水;所述微生物为真菌、细菌或放线菌，优选所述微生物为中国被毛孢L0106、大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21、毕赤酵母X-33、毕赤酵母GS115或犹他游动放线菌中的一种。
[0013]本发明所述的中国被毛孢发酵滤液，可以现有技术制备得到。比如说:采用中国被毛孢(Hirsutella sinensis)L0106，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No = M 2011278，保藏日期2011年8月12日。将中国被毛孢L0106在液体培养基上发酵，获得菌丝体，以及含有发酵上清液和其中的各种代谢产物的发酵产物；将发酵产物经过固液分离，如采用板框过滤等方法，分离出菌丝体后得到发酵滤液。这一滤液可后续利用电渗析装置进行脱盐处理。所述中国被毛孢经发酵培养方法为:将中国被毛孢L0106接种于斜面培养基，于12?16°C条件下进行斜面培养，再取斜面菌接种于种子培养基中，在15-18 °C条件下进行种子培养，而后取种子液按体积浓度1 %的接种量接入发酵培养基，在15-18Γ条件下进行发酵培养获得发酵液;所述的斜面培养基质量组成为:葡萄糖1.8-2.2%、玉米粉0.8-1.2%、土豆汁0.4-0.6% (所述土豆汁是指以200g/L土豆跟水熬制成糊浆液，八层纱布过滤后的滤液)、糊精0.4-0.6%、酵母粉0.4-0.6%、麸皮0.8-1.2%、蚕蛹粉 1.8-2.2%、蛋白胨0.8-1.2%、硫酸镁 0.04-0.06%、磷酸二氢钾0.04-0.06%、琼脂粉0.8-1.2% ,溶剂为水，pH值自然，优选斜面培养基质量组成为:葡萄糖2.0%,玉米粉I.0 %、土豆汁0.5%,糊精0.5 %、酵母粉0.5 %、麸皮1.0%、蚕蛹粉2.0 %、蛋白胨1.0%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.05%、琼脂粉1.0%，溶剂为水，pH值自然;所述的种子培养基和发酵培养基均为液体培养基，所述的液体培养基质量组成为:葡萄糖0.8-1.2%、糖蜜0.8-1.2 %、蚕蛹粉0.4-0.6%,黄豆饼粉0.8-1.2%,酵母膏0.4-0.6%,硫酸镁0.01-0.015%,磷酸二氢钾0.015-0.025%,溶剂为水，pH值自然;优选所述的液体培养基质量组成为:葡萄糖1.0 %、糖蜜1.0 %、蚕蛹粉0.5 %、黄豆饼粉1.0 %、酵母膏0.5 %、硫酸镁0.01%、磷酸二氢钾0.02% ,溶剂为水，pH值自然。
[0014]具体所述中国被毛孢经发酵培养方法为:将中国被毛孢L0106接种于斜面培养基，在12?16°C培养25天，获得斜面菌体;斜面培养基质量组成为:葡萄糖1.8-2.2%、玉米粉0.8-1.2 %、土豆汁 0.4-0.6%、糊精 0.4-0.6%、酵母粉 0.4-0.6%、麸皮 0.8-1.2%、蚕蛹粉I.8-2.2 %、蛋白胨0.8-1.2 %、硫酸镁 0.04-0.06%,磷酸二氢钾 0.04-0.06%,琼脂粉 0.8-1.2%,溶剂为水，pH值自然，优选斜面培养液质量组成为:葡萄糖2.0 %、玉米粉1.0 %、土豆汁0.5%、糊精0.5%、酵母粉0.5%、麸皮1.0%、蚕蛹粉2.0%、蛋白胨1.0%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.05 %、琼脂粉1.0% ,溶剂为水，pH值自然;然后将斜面菌体接种至液体培养基，在100rmp、15-18°C条件下，振荡培养30天，获得种子液;将种子液振荡破碎菌丝体制成种子悬浮液，然后按体积浓度10%的接种量接入一级种子发酵罐内，15-18°C条件下培养5-15天，再由一级种子罐按体积浓度10%的接种量压入二级发酵