一种濒危羊踯躅多态性ssr分子标记开发与应用的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种颜危羊掷躅多态性SSR分子标记开发与应用的方法。
【背景技术】
[0002] 羊掷躅(Rhododendron molle G.Don)，又名黄杜鹊、闹羊花和八厘麻等，是中国羊 踯躅亚属中仅有的一个原生种，具有较高的观赏价值和药用价值。羊踯躅全株器官均含有 多种活性成分，其提取物可治疗类风湿、温疟、慢性肾小球肾炎和高血压等，对血吸虫和多 种害虫也具有非常好的灭杀效果。
[0003] 上世纪80年代以前，羊踯躅遍及华中、华南，西南地区也有少量分布。但由于人们 的滥挖乱采及生境的破坏，羊踯躅的生殖环节受到严重影响，羊踯躅野外分布的地区和种 群数量急剧减少，栖息地已呈"岛屿化"，有些省份野外已难见其踪影，羊踯躅濒于灭绝的风 险日益加剧，亟待加以保护。
[0004] 遗传多样性分析是评价和保护稀有濒危物种的重要指标，能够反映一个物种适应 环境的能力和对环境变迀持续进化的潜力和效应，它能为确定濒危植物优先保护种群和制 定有效的取样策略提供重要依据。简单重复序列（simple sequence repeat，SSR)，广泛存 在于真核基因组中，具有共显性、高度重复性、高度丰富性等优点，是研究群体遗传多样性 的理想工具，但羊踯躅的多态性SSR分子标记还很缺乏。为此本发明利用我们此前对羊踯躅 简化基因组测序(RAD-seq)的数据，合成SSR分子标记引物，鉴定筛选一批多态性SSR分子标 记，应用这些多态性SSR分子标记评估分析濒危羊踯躅遗传多样性和遗传结构，为该物种的 保护提供科学依据和参考。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种濒危羊踯躅多态性SSR分子标记开发与应用的方法， 提供一批可用于群体基因组学、系统发生学及比较基因组学等研究的SSR引物，应用这些多 态性SSR分子标记评估分析颜危羊掷躅遗传多样性和遗传结构，为该物种的保护提供科学 依据和参考。
[0006] 本发明通过以下技术方案来实现的：
[0007] 1、羊踯躅SSR分子标记的获得：利用简化基因组测序技术对濒危羊踯躅 (Rhododendron molle G·Don)基因组进行测序，经序列数据过滤、聚类和组装等步骤，得到 171.5341^的基因组序列，包含498,252〇 〇的丨88，测序质量合格，6(：分布正常，采用33时叟索 软件对contig序列进行SSR检测搜索，最后从11，961微卫星位点中开发得到11，687331?分子 标记；
[0008] 2、SSR分子标记的筛选与合成：从11，687SSR分子标记中选取94对SSR进行遗传多 样性的筛选鉴定，SSR分子标记初选的条件是2个碱基重复单元的SSR需要有10~15个拷贝 的重复，3个碱基重复单元的SSR需要有6~12个拷贝的重复，开发设计好的SSR分子标记引 物序列合成；
[0009] 3、羊踯躅多态性SSR的鉴定:采用不同地理分布的羊踯躅DNA对合成94对SSR引物 进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最后从94对SSR引物中获得16对的多态性SSR分 子标记，见表1;
[0010] 4、羊踯躅多态性SSR分子标记的有效性评估:将筛选获得16对多态性SSR标记在2 个羊踯躅自然居群，每个居群含21个个体，进行PCR扩增，评估分析了这16对多态性SSR标记 能够用于羊踯躅的遗传多样性分析和保护生物学研究，见表1;
[0011] 5、多态性SSR分子标记应用:运用本研究获得的多态性SSR分子标记在8个羊掷躅 自然居群，含193个个体，进行了遗传多样性分析，获得了一些保护羊踯躅的科学依据，即羊 踯躅Shannon多样性指数(I)为1.768，基因多样性指数Η为0.777，江西省金溪县居群的遗传 变异最丰富，而福建政和的遗传多样性水平最低，见表2，PCA分析和UPGMA分析都表明8个自 然群体被分为两组，江西永修居群独立为一组，羊踯躅最好以就地保护为主，应优先保护金 溪、永修居群，同时增加对政和和京山居群的保护权重。
[0012] 本发明的技术效果是:本发明提供一批可用于群体基因组学、系统发生学及比较 基因组学等研究的SSR引物，应用这些多态性 SSR分子标记评估分析濒危羊踯躅遗传多样性 和遗传结构，为该物种的保护提供科学依据和参考。
【附图说明】
[0013] 图1为引物Η88在京山自然居群中的PCR扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，该居群 共22个个体，每个个体扩增效果良好。
[0014] 图2为基于12对SSR分子标记对8个羊踯躅自然居群扩增电泳后，经条带统计，利用 Genalex 6.1和PowerMarker V3.25软件进行分析得到的羊掷躅群体间聚类图，永修居群为 独立居群。
[0015] 在图中，JZ代表安徽金寨居群，PA为浙江磐安，YX为江西永修，JS为湖北京山，JX为 江西金溪，SD为湖南邵东，PY为江西鄱阳，ZH为福建政和。
【具体实施方式】
[0016] 下面将结合附图1、2来详细说明本发明所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好 地理解本发明的实质，但不能对本发明的实施和保护范围构成任何限定。
[0017] 1、羊踯躅SSR分子标记的获得:采用改良的2XCTAB法，提取羊踯躅幼嫩叶片中的 基因组DNA，检测合格的DNA样品交于北京诺禾致源生物信息科技有限公司，采用Illumina HiSeq/MiSeq(11 lumina HiSeq?2500/Miseq?测序平台进行简化基因组技术(RAD-seq)，测 序完成后的Raw Data或Raw Reads，经序列数据质控、过滤，用cd-hit-est聚类软件进行聚 类，用￥61代切?^!114打组装软件对筛选过后的每类测序数据进行组装，得到171.534113的 基因组序列，包含498，252 contigs，采用SSR搜索软件对contig序列进行SSR检测搜索，最 后从11,961微卫星位点中开发得到11，687SSR分子标记；
[0018] 2、SSR分子标记的筛选与合成：从11，687SSR分子标记中选取94对SSR进行羊掷躅 的遗传多样性的筛选鉴定，SSR分子标记初选的条件是2个碱基重复单元的SSR需要有10~ 15个拷贝的重复，3个碱基重复单元的SSR需要有6-12个拷贝的重复，开发设计好的SSR分子 标记引物序列合成；
[0019] 3、羊踯躅多态性SSR的PCR扩增与鉴定:2014年和2015年的4月~5月，采集8个羊踯 躅自然居群，合计193份羊踯躅的幼叶，包括江西省的金溪县，鄱阳县和永修县，福建省的政 和县，安徽省的金寨县，湖南省的邵东县，湖北省的京山县，浙江省的磐安县，采用改良的2 XCTAB法，提取羊踯躅幼嫩叶片中的基因组DNA，从不同居群中选取8个羊踯躅个体的DNA对 合成94对SSR引物进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，PCR扩增体系（15μ1)如:7.5μ1 2XTaq PCR green mix(北京鼎国昌盛生