烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4基因)的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及利用烟曲霉膜联蛋白anxC4及其基因（anxC4基因） 作为对烟曲霉检测的靶标，涉及anxC4基因作为核酸检测、免疫检测、生化检测的检测靶标 的应用，以及应用中得到的烟曲霉的LAMP试剂盒及其引物、荧光定量PCR检测试剂盒及其引 物和TaqMan探针。
【背景技术】
[0002] 烟曲霉临床感染及检测现状
[0003] 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是一种常见的机会致病菌，在环境中分布广泛， 其孢子被免疫缺陷或免疫低下病人吸入后极易引发侵袭性曲霉病，由于其致病机理尚不清 楚，缺乏有效的治疗方法，病死率高达90%。引起侵袭性曲霉病的主要真菌是烟曲霉，一般 病人只有到了患病晚期或死亡后才能检测出烟曲霉感染，因此，对烟曲霉进行早期诊断和 预防至关重要。在过去的几十年里，随着免疫抑制治疗、广谱抗生素的广泛使用，导致患者 体内正常菌群失调以及屏障功能被破坏，从而引起真菌移位、定植以及感染等，烟曲霉感染 患者的数量也不断上升[陈云茹，陈天艳，赵英仁.烟曲霉菌感染的研究进展.临床内科杂 .2011,28(8):54-57.]。国内外学者及临床专家普遍认为，对烟曲霉进行早期诊断并加以及 时治疗是预防侵袭性曲霉病相对有效的方法。因此，建立一种特异性高、准确、灵敏、快速、 方便、成本低廉的烟曲霉检测方法是降低侵袭性曲霉病发生和危害的重要途径。
[0004] 现有的烟曲霉检测方法主要为镜检和培养法，镜检法检出率很低；而传统培养鉴 定方法需要对患者样本先进行48小时以上培养，然后对菌落和微观形态进行直接观察 [Nouer SA,Nucci Μ,Kumar NS ,Grazziutti M,Barlogie B,Anaissie E. Earlier response assessment in invasive aspergillosis based on the kinetics of serum Aspergillus galactomannan:proposal for a new definition.Clin Infect Dis.2011, 53:671-676.]。传统的培养鉴定方法虽然简单、成本低，但耗时太长，灵敏度低，远不能满足 临床上对烟曲霉进行快速准确检测的需要。目前，烟曲霉的检测方法除了传统的培养鉴定 方法外，还有免疫学检测方法和分子生物学检测方法。免疫学检测方法主要是检测半乳甘 露聚糖和l，3-i3-D-葡聚糖，这两种物质都是烟曲霉细胞壁的组成成分，当烟曲霉菌丝在肺 组织中生长时这两种物质就会释放到血液中。但是，由于病人自身的免疫低下以及进行过 抗真菌治疗，用免疫学检测方法可能会产生假阴性或假阳性的结果[Sulahian A， Touratier S,Ribaud P.False positive test for aspergillus antigenemia related to concomitant administration of piperacillin and tazobactam.N Engl J Med. 2003，349:2366-2367.]。分子生物学检测方法主要是通过PCR技术(包括荧光定量PCR) 对烟曲霉的特异性基因进行检测，PCR技术具有特异性高、准确、灵敏、快速等优点，但是PCR 技术对实验人员及环境的要求很高，仪器设备昂贵，同时需要进行严格的温度控制，很难应 用于烟曲霉的临床快速检测[Ostrosky-Zeichner L· Invasive mycoses : diagnostic challenges.Am J Med.2012，125:S14_24.]〇
[0005] LAMP技术介绍
[0006] 环介导恒温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是 由Notomi[Notomi T,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA,Nucleic Acids Res. 2000; 28( 12): 63.]发明的一种新型核酸扩增技术。具体方法是针对靶基因 （DNA 或者cDNA)的6个区域，设计4-6种特异引物，利用链置换DNA聚合酶，在60-65°C的恒温条件 下进行核酸扩增反应，40-50min即可完成核酸扩增反应，在LAMP反应过程中可以形成明显 的副产物一白色的焦磷酸镁沉淀，可通过浊度观察、荧光染料染色，或者对扩增产物进行琼 脂糖凝胶电泳来对反应结果进行判定。LAMP技术具有特异性高、准确度高、灵敏度高、快速 高效、操作简单、检测直观和对仪器设备要求低等特点。自2000年发明以来，LAMP技术已被 迅速用于病原微生物检测、遗传病诊断、食品安全等领域的分子生物学检测。近年来，国外 已将LAMP技术广泛应用于病原体检测，符合疾病检测的快速、准确诊断需要，适合临床推广 应用。
[0007] 实时荧光定量PCR技术介绍
[0008] 实时荧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR，qPCR)是 1996年由美国 Applied Biosystems公司推出的，该技术是指在PCR反应体系中加入焚光基团，利用焚光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[Heid CA， Stevens J,Livak KJ,Williams PM.Real time quantitative PCR.Genome Res.19960ct； 6(10) :986-94.]。与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度 高等特点。实时荧光定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研 究的各个领域。通过该技术可快速、灵敏的检测病毒RNA和DNA以及细菌DNA，该方法已被应 用于人类传染病的诊断和病原定量，以及动物病原体基因的检测，畜禽产品的检验检疫，生 物制品的鉴定等领域[Jozefczuk J，Adjaye J.Quantitative real-time PCR-based analysis of gene expression.Methods Enzymol·2011;500:99-109·]〇
[0009] 烟曲霉anxC4基因介绍
[0010]烟曲霉膜联蛋白anxC4为真菌膜联蛋白家族的新成员，具体功能尚不清楚[Khalaj V,Smith L,Brookman J,Tuckwell D.Identification of a novel class of annexin genes.FEBS Lett.2004Mar 26；562(1-3):79-86.Khalaj V,Azarian B,Enayati S,Vaziri B.Annexin C4in A.fumigatus:a proteomics approach to understand the function.J Proteomics·2011Sep 6;74(10):1950-8·]。
【发明内容】
[0011] 发明人分析得知烟曲霉的anxC4基因序列与其它真菌及人类的基因序列有显著差 异，因此其能作为烟曲霉的理想特异性检测靶标。
[0012] 本发明的一个目的在于提供烟曲霉膜联蛋白anxC4基因（anxC4基因）作为烟曲霉 检测靶标的应用，所述检测包括分子生物学、免疫学和生物化学等检测方法。
[0013] 所述anxC4基因序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。
[0014]所述应用是以anxC4基因作为核酸检测靶标，是指将anxC4基因序列或其互补序 列、anxC4蛋白或多肽及其抗体应用于烟曲霉检测，包括以anxC4基因作为对烟曲霉进行核 酸扩增检测的引物和探针的设计模板而扩增得到扩增子为anxC4基因部分或全部序列的过 程;所述的核酸扩增检测包括普通PCR、荧光定量PCR、等温扩增及其他通过扩增anxC4基因 序列对烟曲霉的核酸检测。
[0015] 所述的应用是以anxC4蛋白作为检测靶标，是指将anxC4蛋白或其多肽，或其抗体 应用于烟曲霉检测。
[0016] 本发明另一目的在于以烟曲霉anxC4基因序列作为设计模板，提供了用于对烟曲 霉进行LAMP检测的引物，以实现烟曲霉的批量检测，提高检测的特异性和灵敏度。
[0017] 本发明所提供的用于检测烟曲霉的LAMP引物，是根据烟曲霉膜联蛋白anxC4基因 (anxC4，序列表中SEQ ID NO: 1所示）设计的，用以定性检测痰、血液、支气管肺泡灌洗液等 待测样品中的烟曲霉基因组DNA，所述LAMP引物是由四条引物组成的引物组合，包括外引物 ?3、83和内引物？1?、81?按摩尔比5:40的组合。
[0018] 具体来讲，所述用于对烟曲霉进行LAMP检测的四条引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID N0:2(F3)、SEQ ID N0:3(B3)、SEQ ID N0:4(FIP)和SEQ ID N0:5(BIP)所示。
[0019] 对烟曲霉进行LAMP检测的试剂盒也属于本发明。该试剂盒中包括上述用于对烟曲 霉进行LAMP检测的引物。具体来讲，所述试剂盒包括以下用于25yL LAMP反应体系的试剂:2 X反应缓冲液12.5yL，Bst DNA(8000U/ml)聚合酶lyL，去离子水5.5yL，引物加入量为： 5pmol引物F31yL，5pmol引物B31yL，40pmol引物FIP lyL，40pmol 引物BIP lyL。为方便检 测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为烟曲霉标准株基因组 DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系，如双蒸水、无菌去离子水。
[0020] 上述LAMP引物或试剂盒在烟曲霉LAMP检测中的应用也属于本发明。使用所述试剂 盒对烟曲霉的LAMP检测可包括以下步骤：
[0021] 1)以待测样品基因组DNA为模板，在上述LAMP引物的引导下进行LAMP扩增，25yL LAMP反应液包括:待测样品基因组DNA 2yL，2 X反应缓冲液12.5yL，Bst DNA聚合酶(8000U/ ml) lyL，去离子水5.5yL，引物加入量为：5pmo 1引物F3 lyL，5pmo 1引物B3 lyL，40pmo 1引物FIP lyL，40pmol引物BIP lyL; LAMP扩增条件为:置60-65°C恒温60min左右；
[0022] 2)LAMP扩增结束后进行结果判定，结果判定可采用以下三种方法：
[0023] 2.1用浊度仪检测LAMP扩增前后反应液的浊度变化，根据浊度变化判断结果:浊度 上升表示待测样品中存在烟曲霉（阳性），浊度无变化表示待测样品中不存在烟曲霉（阴 性)；
[0024] 2.2在LA