检测样品中是否存在五加科植物成分及是否掺伪的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测样品中是否存在五加科植物成分及是否掺伪的方法，尤其涉及检 测待检三七样品中是否掺伪的方法。
【背景技术】
[0002] 五加科植物为双子叶植物，可供药用的五加科植物包括人参、三七、西洋参等，目 前对于五加科植物的鉴别主要采用传统形态学方法，依赖鉴别人员经验，主观性高，因此需 要一种能够准确、有效的鉴别方法。
[0003] 在含五加科植物成分的混合物例如药材、或者以五加科植物入药的中药制剂等的 生产加工过程中，部分DNA通常能够保留于其中，因此，混合物中的五加科植物成分可以从 其携带的DNA检测中获得鉴定。
[0004] 然而，在混合物特别是药材、中药制剂中五加科植物成分鉴定的研究技术上，由于 混合物中五加科植物DNA含量很低，并且含有多种抑制PCR反应的成分，此外，含五加科植物 的混合物特别是中药制剂中通常还具有较多的其它动植物物种，因此，如何设计五加科植 物特异性引物也成为鉴定技术的关键。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种检测样品中是否存在五加科植物成分的方法，所 述方法具有特异性强、速度快、准确性高等优点。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种鉴定待检三七样品是否掺伪的方法，该方法具有 特异性强、速度快、准确性高等优点。
[0007] 本发明的再一目的在于提供实现本发明所述检测样品中是否存在五加科植物成 分的方法或鉴定待检三七样品中是否掺伪的方法的引物对。
[0008] 本发明的再一目的在于提供所述引物对的应用。
[0009] 本发明的再一目的在于提供包含所述引物对的试剂盒。
[0010]为实现上述目的，本发明提供一种检测样品中是否存在五加科植物成分的方法， 该方法包括：
[0011]从待检样品中提取总DNA;
[0012] 以所提取的总DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增;所述引物对包括SEQ ID NO: 1 和SEQ ID N0:2;
[0013] SEQ ID N0：1：CGGAGGGGCGGATAATGG；
[0014] SEQ ID N0：2：CGCACGACATGAGAAGAGG；
[0015] 对上述PCR扩增产物进行分析判断以鉴别所述检测样品中是否存在五加科植物成 分。
[0016] 优选地，在本发明检测样品中是否存在五加科植物成分的方法中，所述对上述PCR 扩增产物进行分析判断包括用凝胶电泳显示所述扩增产物，并包括对照与从相应的五加科 植物对照品中提取的DNA进行PCR扩增的结果。
[0017] 本发明所述"相应的五加科植物对照品"取决于待检五加科植物的种类，例如当本 发明用于检测样品中是否存在三七成分时，"相应的五加科植物对照品"即为三七对照品。 优选地，在本发明检测样品中是否存在五加科植物成分的方法中，所述五加科植物选自三 七、人参和/或西洋参。
[0018] 本发明SEQ ID N0:1和2为根据真核生物r DNA上的ITS2顺反子序列设计，相较于 ITS 2的通用序列，其能特异性地使五加科植物的ITS 2片段序列进行扩增，尤其是特异性 地使人参、三七、西洋参的ITS2片段序列进行扩增，而不能扩增其它科属的植物药材，因此， 可以检测样品中是否存在五加科植物成分，尤其是人参、三七和/或西洋参成分。
[0019] 三七属于五加科植物，其具有止血、活血化瘀、消肿定痛、滋补强壮、抗疲劳、耐缺 氧、抗衰老、降血脂、降血糖、提高机体免疫功能等作用，近来受到追捧，尤其是三七细粉、三 七最细粉或三七极细粉，价格居高不下，不法商贩为谋求利益通常会在三七细粉中掺入植 物源性中药材/饮片粉末，例如五加科植物的粉末，以减低成本，按现有的鉴别方法，掺入植 物源性中药材/饮片粉末的三七细粉很难被鉴别出来，一方面主要是因为药材粉末被破碎 成最细粉或极细粉后就没有了细胞结构，检测人员很难通过亚细胞结果的观察来辨别中药 材的来源和种属。另一方面，在化学成分检测中，《中国药典》的要求是主要成分人参皂苷 Rbi、人参皂苷Re、人参皂苷Rgl以及三七皂苷Ri检出（定性，薄层色谱)或规定人参皂苷Rgl、 人参皂苷Rbi以及三七皂苷办的总量不得少于5.0% (定量，高效液相色谱），但是对于和三七 药材同属的非药用植物或价格较低廉的同属药材，也可能含有较高量的待测化学成分，但 并无三七药材所具有的药用功效，或者不法分子可以人为掺入一些规定的检定成分，类似 于牛奶中掺入三聚氰胺的原理，以干扰检验检测结果，从而达到降低成本的目的。例如，较 人参等五加科植物，三七的检测仅多了一项三七特有的三七皂苷Ri的检测，但不同大小和 生长年份的三七，其三七皂苷心含量相差较明显，因此，即使掺入人参后，通过化学成分检 测也很难发现。
[0020] 尽管可将待测三七制剂的PCR扩增结果与从三七中提取DNA进行PCR扩增的结果进 行对照，以确定待检三七制剂是否掺伪，但应用PCR扩增方法具有如下缺陷：
[0021] ①所用时间较长，一般的药材基因组提取到PCR完成大概学要1天的时间，再送去 测序一般需要48小时，再进行分析，一个检测过程大概需要3~4天；
[0022] ②用于药材粉末很多情况下是真品和伪品的混合物，若采用通用引物进行检测， 所得的PCR产物也是两种或多种植物的混合DNA产物，测序时会出现大量杂峰堆积在一起无 法分析的现象。
[0023]本发明在利用所述引物对特异性扩增三七、人参、西洋参ITS2序列的基础上，还可 开发出一种鉴定待检三七样品是否掺伪的方法，具体而言，本发明还可提供一种鉴定待检 三七样品是否掺伪的方法，所述方法包括如下步骤：
[0024] 从待检三七样品中提取总DNA;
[0025]以所提取的总DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增;所述引物对包括SEQ ID NO: 1 和SEQ ID NO:2;
[0026] SEQ ID NO：1：CGGAGGGGCGGATAATGG；
[0027] SEQ IDN0：2：CGCACGACATGAGAAGAGG；
[0028]测试上述扩增结果的高分辨熔解曲线(HRM)并进行分析判断待检三七样品是否掺 伪。
[0029] 如上所述，本发明SEQ ID N0:1和2为根据真核生物r DNA上的ITS2顺反子序列设 计，相较于ITS 2的通用序列，其能特异性地使五加科植物的ITS 2片段序列进行扩增，尤其 是特异性地使人参、三七、西洋参的ITS2片段序列进行扩增，而不能扩增其它科属的植物药 材，因此，可以检测样品中是否存在五加科植物成分，尤其是人参、三七和/或西洋参成分。 但如果仅仅利用PCR结果的凝胶电泳难以快速将人参、三七和西洋参区分开来的，这主要是 因为人参、三七和西洋参均属于五加科植物，采用SEQ ID NO: 1和2对三种药材进行PCR反 应，所得PCR产物片断大小相同，仅仅有个别碱基存在差异，人参、三七、西洋参PCR扩增产物 分别如下所示：
[0030]人参（Panax ginseng)
[0031]
[0036]因此，仅仅利用PCR结果的凝胶电泳对SEQ ID NO: 1和2扩增后的PCR产物进行分析 是难以快速将人参、三七或西洋参鉴别出来。如果样品是粉末，现有技术手段更是无能为 力，这主要是因为现有的粉末一般无细胞结构，无法采用显微技术;而对于化学成分检测， 由于三七的检测较人参、西洋参仅多了一项三七特有的三七皂苷Ri的检测，但不同大小和 生长年份的三七，其三七皂苷办含量相差较明显，因此，即使掺入人参、西洋参后，通过化学 成分检测也很难发现。本发明发现高分辨率熔融曲线(HRM)可以有效区分如上所述的仅有 个别碱基差异的三七、人参、西洋参的PCR产物，从而能有效鉴定待检三七样品是否掺伪。 [0037]优选地，在本发明所述鉴定待检三七样品是否掺伪的方法中，用于掺伪的伪品为 人参和/或西洋参，更优选地，所述伪品为人参。人参、西洋参与三七为同属植物，本发明采 用SEQ ID NO: 1和2引物对所提取到的总DNA中的ITS 2序列进行扩增，再利用高分辨率熔解 曲线分析技术，可对三七样品中是否掺入人参、西洋参实现快速，准确性高的检测。本发明 仅仅需要约5~7个小时就可以完成从基因组DNA提取到样品分析的全过程。
[0038]根据本发明的具体实施方案，在本发明所述鉴定待检三七样品是否掺伪的方法 中，所述待检三七样品为中药细粉、中药最细粉或中药极细粉；
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