基于arms荧光pcr法检测基因多态性的通用型荧光发夹引物的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种基于ARMS荧光PCR法检测基因多 态性的通用型荧光发夹引物。
【背景技术】
[0002] 基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因点突变包括 了单核苷酸突变，核苷酸缺失，核苷酸插入等。单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上 由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。基因点突变检测主要方法有PCR-PFLP检测 技术、DNA直接测序法、等位基因特异性PCR( AS-PCR)法、Taqman探针法、PCR-焦磷酸测序法 和PCR-芯片法等。PCR-PFLP技术依赖限制性内切酶消化、电泳分析等原因，往往反应时间 长，需要反复开管，容易出现交叉污染和结果误判现象，影响其检测准确率，同时通量较低， 不适用于大量人群和临检的快速筛选和临床诊断。DNA直接测序法虽然是基因检测金标准， 但是需要昂贵的仪器设备和复杂的操作流程以及检测周期长的特点，大多数实验室难以实 现，亦不适合临床检验。PCR-芯片杂交法具有多项优点，CFDA已批准多个PCR-芯片杂交法检 测多态性试剂盒，然而芯片检测操作复杂，对专业水平要求高，芯片杂交耗时长，灵活度低， 成本高，需要特殊的仪器设备。PCR-焦磷酸测序法适合各种通量，灵敏度高，但是检测设备 昂贵，比较适合于较大样本、突变比例高于5%的各种类型SNP检测的确定。等位基因特异性 PCR(AS-PCR)电泳法灵敏度高，但通量低，非常适合小型实验室检测，但是因为需要电泳，检 测时间长，容易出现误判。Taqman探针法使用荧光探针，灵敏度高，操作简单，仪器设备易普 及且适合各种通量，但是荧光探针价格昂贵，且每个SNP位点需设计两个等位基因的特异性 探针，研发阶段成本非常高。因此，根据我国基层医院检测的实际情况，设计一种灵敏度高， 检测方法简便，仪器成本少且适合各种通量的新的检测基因多态性的方法尤为迫切。
[0003] ARMS-PCR技术即扩增受阻突变系统（Amplification Refractory Mutation System ARMS-PCR)，又称为等位基因特异性扩增法(Allele Specific Amplification,AS-PCR)。其基本原理是设计两条特异性ARMS引物，引物3'端最后一个碱基分别与野生型或突 变型碱基相同，另外一条是通用型反向引物。在进行PCR反应时，由于Taq DNA聚合酶缺少3' -5'外切酶活性，若引物3'端形成错配，链延伸反应受阻，在一定扩增循环内，不会检测出 特异的扩增产物;反之，3 '端配对则能够检测出扩增产物。
[0004] 焚光发夹引物（Fluorescence Hairpin Primer，FHP)，又称LUX引物（Light-Upon extension引物），是一种5'和3'端具有互补回文结构，并在靠近3'末端的dT碱基上进行荧 光基团单标的引物。这条引物在游离状态下可形成发夹结构(茎环结构），而这种DNA构象本 身具有自淬灭荧光基团的特性，不需要在另一端标记淬灭基团。当发夹引物和模板配对并 在Taq DNA聚合酶作用下PCR产物获得延伸以后，这个发夹结构即打开，释放荧光，导致荧光 信号显著增加，可以用荧光定量PCR仪进行定量。由于3'端可标记多种荧光基团，因此应用 这种发夹型荧光引物可实现多重荧光PCR。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种基于ARMS荧光PCR法检测基因多态性的通用型荧光发夹 引物。
[0006] 本发明的另一目的是针对现有技术检测MTHFR基因多态性的价格昂贵、周期长、低 效率、数据分析繁琐等不足，提供了一种基于荧光定量PCR技术平台，结合ARMS-PCR和荧光 发夹引物的基因点突变检测方法。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明的一种基于ARMS荧光PCR法检测基因多态性的通用 型荧光发夹引物(FHP引物，图la)，所述引物包括(Seq ID N〇:l-2):
[0008] 野生型荧光发夹引物FHPU' -GATCGAGTACCTACCTTGTTCGATC-3'
[0009] 突变型荧光发夹引物FHP-Mj' -GACTGAGTAGTTCTGCGTCATCAGTC-3'
[0010] 所述通用型荧光发夹引物的序列长度为26-27bp，且序列与人基因组不同源或不 能完全同源。该引物是一种5'和3'端具有回文结构的引物，具有4-7个碱基的互补序列，可 形成发夹结构，且在靠近3'末端dT碱基上进行荧光基团单标。引物在游离状态下形成的发 夹结构的构象本身具有自淬灭荧光的特性。由于发夹荧光引物在PCR过程中易于打开，因此 当引物和模板配对的时候，该发夹结构打开后释放荧光，导致荧光信号显著增加，且作为 PCR引物可在Taq酶作用下获得延伸，产生带有荧光标记的PCR产物，可以用荧光定量PCR仪 进行定量。当发夹结构的Δ G最佳范围为-1.6~-5.8kcal/mol，结构易于打开，可与模板互 补配对，获得最佳荧光淬灭效果。发夹引物的熔解温度应该在60°C-68°C之间。目前常用的 荧光基团包括FAM、TET、J0E、HEX、AlexaFluor 546、Alexa 594等。优选使用荧光基团包括 FAM和HEX。碱基序列通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适 宜方法纯化。
[0011]本发明中，所述ARMS特异性扩增引物是指由一定数量的dNTPs构成的寡核苷酸序 列，通常由DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。在聚 合酶链式反应中，引物可与待扩增目的核酸链上与之互补的区域结合，其功能是作为核苷 酸聚合作用的起始点，在引物的3'_0H上，核苷酸以二酯键形式进行合成，因此引物的3'-OH 必须是游离的。DNA聚合酶可由其3'端开始进行延伸，合成新的核酸链。一般说来，用于识别 基因点突变位置的ARMS特异性扩增引物包括两条。在引物3'端最后一个碱基分别为识别野 生型或突变型的碱基。
[0012]本发明还提供含有所述通用型荧光发夹引物的用于ARMS荧光PCR法检测基因多态 性的试剂盒。
[0013] 优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、K+、TriS-HC1、PCR反应缓 冲液等中的至少一种。
[0014] 本发明还提供所述通用型荧光发夹引物、或所述试剂盒在ARMS荧光PCR法检测基 因多态性中的应用。
[0015] 本发明还提供基于ARMS荧光PCR法检须彳基因 MTHFR多态性的特异性引物，包括正向 引物MTHFR-C677T-W、正向引物MTHFR-C677T-M以及一条反向共用引物，所述正向引物由标 签序列、特异性引物序列和3'端特异性碱基组成（图lb)。标签序列的碱基组成分别与两条 通用型荧光发夹引物序列完全和部分相同（至少大于18bp)。特异性引物序列与所扩增基因 点突变位置(MTHFR C677T)上游序列相同，用于特异性识别和结合基因组DNA。两条ARMS特 异性引物的3'端特异性碱基分别与野生型碱基和突变型碱基相同，主要用于ARMS-PCR反应 中阻碍Taq DNA聚合酶延伸。一条反向共用引物，用于ARMS-PCR扩增，其序列3 '端不能与通 用型荧光发夹引物和ARMS特异性引物形成互补配对。
[0016] 所述引物包括（Seq ID No:3-5):
[0017] 正向引 物 MTHFR-C677T-W:5'_ GATCGAGTACCTACCTTGTTCGATCGAGAAGGTGTCTGCGGGTGC-3'
[0018] 正向引 物 MTHFR-C677T-M:5'_ GACTGAGTAGTTCTGCGTCATCAGTCGAGAAGGTGTCTGCGGGCGT-3，
[0019 ]反向共用引物R: 5 ' -CAAAGCGGAAGAATGTGTCAG-3，
[0020] 本发明还提供含有所述特异性引物的用于ARMS荧光PCR法检测基因 MTHFR多态性 的试剂盒。
[0021] 优选地，所述试剂盒还包括所述通用型荧光发夹引物(FHP-W和FHP-M)、dNTPs、Taq DNA聚合酶、1% 2+、1(+、1^8-!1(：1、？0?反应缓冲液中的至少一种。
[0022]具体而言，试剂盒包括荧光PCR-ARMS反应液(Master Mix)和特异性扩增引物混合 液(Primer Mix)。荧光PCR-ARMS反应液(Master Mix)包含了PCR反应必须的Taq DNA聚合 酶、缓冲液、镁离子、dNTPs等物质外，还包含一对通用型发夹荧光引物。ARMS引物混合液 (Primer Mix)则包含检测对应基因点突变的正向的野生型和突变型的特异性扩增引物 (MTHFR-C677T-W和MTHFR-C677T-M)、对应基因点突变的反向共用引物R。
[0023] 所述试剂盒应用的反应体系如下：2 XMaster Mix 5μ1，Primer Mix 2μ1，模板DNA l_10ng，ddH2〇 补足至 10μ1。