一种检测致病性犬钩端螺旋体的pcr引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测引物与试剂盒，具体地说，涉及检测致病性犬钩端螺旋体的PCR引 物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 钩端螺旋体病(Leptospirosis)是一种在全世界范围传播的人畜共患疾病，简称 钩体病，该病尤其广泛存在于发展中国家和热带地区。犬对该病易感，感染后临床表现多 样，不易进行诊断。钩体病的病原体会持续存在于宿主机体内，会进一步扩散污染环境，感 染其他人和动物，危害严重。因而，犬患该病后，在危害其本身的健康的同时，还会威胁到其 主人的安全。因此，需要在早期对该病作出诊断，尽早控制该病。目前，诊断犬钩体病的方法 有直接镜检、分离培养、血清学检测、动物接种等实验室检测方法，与这些方法相比，PCR方 法更省时省力，特异性和敏感性优异，并且可用于钩体病的早期诊断。
[0003][0004]
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种省时省力，特异性和 敏感性优异，检测犬钩端螺旋体LigB基因的PCR引物及试剂盒，可用于犬钩端螺旋体病的早 期诊断。
[0006] 本发明原理在于选择了犬钩端螺旋体LigB基因作为检测对象，并针对犬钩端螺旋 体LigB基因特殊设计了引物，使引物具有优异的特异性和敏感性。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0008] 本发明提供一种检测致病性犬钩端螺旋体的PCR引物，所述引物如下：
[0009] 上游引物：5' -CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA-3' ；
[0010] 下游引物：5 ' -GATCCTTGTATTCCACCGATG-3 '。
[0011]所述引物的扩增片段长度为124bp。
[0012] 本发明还提供了所述引物在制备检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒方面的应用。
[0013] 由于所述引物的扩增片段能够证明犬钩端螺旋体LigB基因的存在，从而证明致病 性犬钩端螺旋体的存在，因此，所述引物可用来制备检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒。
[0014] 基于上述原因，本发明还提供了含有所述引物的试剂或试剂盒。
[0015] 具体为一种检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒，所述试剂盒包括前述引物、阳性 对照、阴性对照、Taq 酶、dNTP、10 X Buf f er、ddH20 〇
[0016] 进一步地，所述阳性对照的构建方法为：
[0017] 1)以波摩那56608的基因组DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩 增，对PCR产物进行纯化回收，与pMD18-T进行连接；
[0018] 2)向Transl-Tl克隆感受态中加入步骤1)获得的连接产物，筛选阳性克隆，提取质 粒。
[0019] 波摩那56608购自中国药品生物制品检定所钩端螺旋体实验室，保藏编号为 56608〇
[0020]为了更好的实现对致病性犬钩端螺旋体的检测，本发明优化了所述试剂盒的工作 程序(尤其是退火温度），使所述引物能够最大程度地增加反应成功率和反应效果。
[0021] 优化得到的工作程序为：94°C预变性3min; 94°C变性30 s，58°C退火30 s，72°C延伸 30s，29 个循环；72°C 延伸 5min。
[0022] 本发明的有益效果在于：
[0023] 本发明选择LigB基因作为检测对象，实现检测致病性钩端螺旋体的目的。本发明 提供了省时省力，特异性和敏感性优异，检测犬钩端螺旋体LigB基因的PCR引物及试剂盒。 本发明提供的引物和试剂盒，可用于犬钩端螺旋体病的早期诊断在该实验中，建立并组装 的犬钩体病PCR方法特异性强，并且检测钩体浓度的灵敏度可达到lOkopies/yL。
【附图说明】
[0024]图1是本发明实施例2中摸索退火温度的电泳检测结果图：其中，M:2000bp Marker，泳道1 ~5:退火温度依次为56 °C，57 °C，58 °C，59 °C，60 °C。
[0025]图2是本发明实施例3中灵敏度试验的电泳检测结果图：其中，M:2000bp Marker， 泳道1~6分别为；1 X 10-6ng/yL-lng/yL，10倍梯度。
[0026]图3是本发明实施例4中重复性试验的电泳检测结果图：其中，M:2000bp Marker， 泳道1~3为同浓度同批次的模板DNA。
[0027]图4本发明实施例5中特异性试验的电泳检测结果图：其中，M: 2000bp Marker，泳 道1~8模板浓度依次为黄疸出血56601，犬56603,波摩那56608,非致病性钩体566505,流感 伤寒56609，七日热56610，塔拉索夫56635和空白对照。
[0028] 图5本发明实施例8中标准阳性质粒的灵敏度电泳结果图：泳道1-9分别为10°-108copies/iiL〇
[0029] 图6本发明实施例8中菌液的PCR检测灵敏度电泳结果图：泳道1-7分别为ΙΟΜΟ7钩 体/ml。
【具体实施方式】
[0030] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0031 ]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 1、菌株和临床样本
[0034] 钩端螺旋体标准菌株黄疸出血56601，犬56603，波摩那56608，流感伤寒56609，七 日热56610,塔拉索夫56635,非致病性钩体566505,由课题所在实验室传代培养保存。
[0035] 2、主要仪器和试剂
[0036] 凝胶电泳图像分析系统（北京六一仪器厂，中国）；梯度PCR仪(Biometra UNO，德 国）；C02恒温培养箱(SANYO,日本），细菌基因组DNA提取试剂盒以及胶回收试剂盒购自天根 公司，质粒小量提取试剂盒购自OMEGA公司，；Taq酶、pMD_18t载体、Transl-Tl克隆感受态购 自大连宝生物有限公司；胰蛋白胨购自英国Oxoid公司，氨苄青霉素购自NEB公司，氯化钠、 琼脂糖等常规试剂购自国产公司。
[0037] 实施例1引物设计与合成
[0038] 根据GenBank中已发表的LigB基因序列，应用Primer Premier 5.0软件设计得到 引物，经筛选得到本发明所述的引物。
[0039] 筛选得到的引物通过NCBI中的BLAST进行特异性鉴定，如表1所示。引物均由大连 宝生物公司合成。
[0040] 表1通用引物序列
[0041]
[0042]实施例2 PCR反应程序的优化
[0043]根据细菌组DNA提取试剂盒产品说明，从生长良好的钩体菌液提取DNA作为模板。 [0044]以钩体DNA为模板，首先对PCR反应的退火温度进行摸索，反应体系和条件：10yL， Taq酶0 · lyL，实施例 1 所述上下游引物各0 · 5yL，dNTPO · 8yL，模版lyL，10 X Buf f er lyL， ddH20补足。
[0045] 反应条件：941€3111丨11;941€3〇8，退火温度3〇8,72 1€3〇8,29个循环；721€5111丨11。在梯 度PCR仪上进行，退火温度设置温度梯度，分别为:56.0 °C，57.0 °C，58.0 °C，59.0 °C，60.0 °C。 进行PCR反应，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳观察结果，如图1所示。由图1可知，当退火 温度为58.0 °C时，条带最亮，检测效果最好。
[0046] 实施例3灵敏度试验
[0047]将实施例2提取的DNA模板经过定量作为标准品，稀释成Ing/yL，而后进行10倍梯 度稀释，分别稀释