利用ssr指纹图谱鉴别舒茶早茶树品种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种利用SSR指纹图谱鉴别舒茶早茶 树品种的方法。
【背景技术】
[0002] 舒茶早无性系，灌木型，中叶类，早生种，由安徽省舒城县农业技术推广中心于 1975-1994年从舒城舒茶镇九一六茶场采用单株育种法选育而成，1995年安徽省农作物品 种审定委员会审定为省级品种，2002年舒茶早由全国农作物品种审定委员会审定为国家品 种。树姿半开张，分枝较密，叶片稍上斜状着生，叶片长椭圆，叶色深绿，有光泽，叶质厚较 软。芽叶生育力强，发芽整齐，长势强。一芽三叶盛期在4月上旬，产量高，主要分布在安徽江 北茶区，安徽岳西、金寨、东至山东茶区已有大面积种植。适合制作茶树，如舒城小兰花和岳 西翠兰，制兰花茶，外形色泽翠绿，香气清鲜持久，滋味醇厚。
[0003] 随着国家对植物新品种保护制度不断的完善，越来越多的育种者对新品种权保护 的意识增强，积极申请新品种保护。由舒茶早所制成的"小兰花茶"是当地名茶，每年都会有 不同的新品种出现，而仅凭肉眼从外观形态上很难辨别真伪，随着国家对植物新品种保护 制度的不断完善，急需开发有效的技术措施对舒茶早优良品种进行精准鉴定。本发明利用 SSR指纹图谱技术对舒茶早品种进行鉴定，从DNA水平上给予舒茶早独特的指纹身份，有效 防止其他品种冒充舒茶早，从而达到保护舒茶早优良品种的目的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种利用SSR指纹图谱鉴别舒茶早茶树品种的方法。
[0005] 本发明利用SSR指纹图谱技术鉴别舒茶早品种，其中涉及茶树基因组中三个特异 的微卫星SSR标记，该标记的重复单元是由二碱基和三碱基组成，是茶树基因组中比较丰富 的微卫星标记，分别为:① SSR-54:5' -AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG-3';②SSR-256:5'-AAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG-3' ; ?SSRISSj^ATGATGATGATGATGATGATGATGATG-37 〇(SEQ ID No:1-3)〇
[0006] 上述标记SSR-54、SSR-256和SSR-285的左、右侧翼保守序列分别如SEQ ID Νο:6和 7、SEQIDNo:l(^Pll&&SEQIDNo:l^P15m*。
[0007] 基于SSR引物设计原则，根据上述SSR标记的侧翼序列设计引物，引物序列为：
[0008] SSR-54引物序列为：
[0009] 上游引物：5' -AGACACGAAATAGGTAGG-3'，Tm: 51 · 4°C (SEQ ID No: 4)
[0010] 下游引物:5/-AGACACGAAATAGGTAGG-3 /，Tm:51·4°C(SEQIDNo:5)
[0011] SSR-256引物序列为：
[0012] 上游引物：5/-ACTGGTAGGCGACAAACT-3 /，Tm:53°C(SEQIDNo:8)
[0013] 下游引物：5/-GCGACCCAAATCACTTAG-3 /，Tm:53°C(SEQIDNo:9)
[0014] SSR-285引物序列为：
[0015] 上游引物：5/-GCCATAAAGAGCAACAAG-3 /，Tm:51·4。C(SEQIDNo:12)
[0016] 下游引物：5/-CCTCACCATAACAACACC-3 /，Tm:53。C(SEQIDNo:13)
[0017] SSR引物的筛选步骤如下：以32份来自12个省份的优良茶树品种作为样本材料，进 行样品总DNA的提取，根据茶树全基因组序列进行SSR位点的选择和引物的设计筛选，通过 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳初筛，然后采用Fragment Analyzer ?全自动毛细管电泳系统复 筛，根据电泳结果筛选出核心引物。
[0018] 本发明中茶树总DNA提取是采用改良的CTAB法从干茶或茶树叶片中提取基因组 DNA。对茶树全基因组序列进行SSR标记的选择和引物设计筛选，在获得10万个含SSR位点的 序列中，二碱基和三碱基是茶树基因组中比较丰富的微卫星类型，从中选取2923条含有SSR 位点的序列，成功设计了415对引物，其中SSR引物筛选的原则如下：
[0019] ①引物的长度为18-23bp，目的片段在250bp左右。
[0020] ②GC含量为45%-55%，引物序列中避免出现3或4个连续碱基。
[0021] ③退火温度在45°c-55°c，最好在50°C左右，上、下游引物Tm值相差不大于4°C。
[0022] ④引物3 '端避免出现A或出现3个以上连续碱基，尽量避免引物二聚体和发夹结 构。
[0023] 所述的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳初筛，具体是将PCR产物通过2 %琼脂糖凝胶电 泳，选取扩增率大于等于75%、条带单一的PCR产物进行测序，通过与目的片段比对进行引 物的初筛。并通过Fragment Analyzer ?全自动毛细管电泳系统进行复筛，能够精确地反映 等位位点间的差异，筛选出多态性高的引物，最终确定了三对核心引物SSR-54(SEQ ID No: 4和5)、SSR-256(SEQIDNo:8和9)和SSR-285(SEQIDNo:12和13)，其PIC值分别为0·882、 0.900和0.886，用于舒茶早品种的鉴定。
[0024] 本发明还提供一种利用SSR指纹图谱鉴别舒茶早茶树品种的方法，包括如下步骤：
[0025] 1)提取待测植株的基因组DNA;
[0026] 2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用所述核心引物，进行PCR扩增反应；
[0027] 3)检测PCR扩增产物，如果用引物SSR-54能够扩增出193bp和221bp大小的特征条 带，则待测植株为舒茶早茶树品种。
[0028] PCR扩增体系：50ng/yL基因组DNA 2yL，ΙΟμΜ上、下游引物各0.5yL，10 X EasyTaq酶 缓冲液2yL，EasyTaq DNA聚合酶lU，2.5mM dNTP 2yL，ddH20加至总量20yL。
[0029] PCR 程序：94 °C 预变性 5min; 94 °C 变性 30s，55 °C 退火 30s，72 °C 延伸 30s，共 30 个循 环;72°C延伸10min，4°C保存。
[0030] 步骤3)中采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，然后银染显色;或者通过毛 细管电泳检测PCR扩增产物。
[0031] 优选用Fragment Analyzer ?全自动毛细管电泳系统检测PCR扩增产物，由于 Fragment Analyzer ?全自动毛细管电泳系统最低分辨为2bp，因此利用所述核心引物对待 测植株扩增出的特征条带分别是193 ± 3bp、221 ± 3bp，均可判定为舒茶早品种。
[0032]本发明进一步提供用于筛选或鉴别舒茶早茶树品种的PCR检测试剂盒，所述检测 试剂盒包含上述核心引物SSR-54(SEQ ID No:4和5)和/或SSR-256(SEQ ID No:8和9)和/或 SSR-285(SEQIDNo:12和13)。
[0033]本发明具有以下优点：
[0034](一)本发明基于茶树基因组开发出SSR引物，与EST-SSR相比，具有多态性高、数量 多的特点。通过大量的引物筛选，最终确定三对核心引物用于对舒茶早品种的鉴定。
[0035](二)本发明采用SSR指纹图谱技术，该技术具有稳定性好、操作简单，准确率高的 特点，对舒茶早优良品种鉴定提供一种精确、快速、简单的方法。
[0036](三)本发明所选用的材料不受季节、环境和测试时间的限制，可以对舒茶早品种 生长任何时期内的任意器官，或制作好储存一段时间的干茶进行DNA提取，均不会影响鉴定 结果。
[0037](四）本发明进行引物筛选优选用Fragment Analyzer ?全自动毛细管电泳系统， 该系统具有高通量、安全方便、灵敏度高等特点，对构建一套快速、精确的SSR指纹图谱技术 起到重要作用，并缩短了舒茶早优良品种鉴定的周期。
【附图说明】
[0038]图1为本发明实施例1中干茶或鲜叶总DNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0039]图2为本发明实施例3中利用核心SSR引物对32个茶树品种进行PCR检测的琼脂糖 凝胶电泳结果。
[0040] 图3-图5分别为本发明实施例3中32个茶树品种的SSR指纹图谱。
[0041] 图6为本发明实施例3中三对核心引物的PCR扩增产物测序结果与目的片段比对 图，旨在验证引物的真实性，即扩增产物序列中是否包含SSR位点。
【具体实施方式】
[0042] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0043] 以下实施例中引物序列由上海生工合成，PCR扩增产物测序工作由上海生工完成。 PCR反应试剂购自Transgeng公司。
[0044] 以下实施例中使用的CTAB提取液配方如下：20mM EDTA，100mM Tris-HCl，0.075v/ ν%〇β-巯基乙醇，1 .OmM NaCl，4w/v%PVPP-40，CTAB/SDS 2w/v% (十六烷基三甲基溴化铵和 十二烷基硫酸钠质量比1:6)。
[0045] 实施例1干茶或鲜叶总DNA的提取
[0046]实验对象:所用茶树品种见表1。
[0047] 表1茶树品种
[0048]
[0049] 注:其中编号1、2、3、4、15、16、17、24、25、30对应的品种为国家级品种，5、6、7、8、9、 10、14、19、20、21、22、23、26、27、28、29对应的品种为省级品种，12、13为黄山野生茶树。 [0050]用改良的CTAB法从干茶或鲜叶中提取总DNA，具体操作如下：
[00511①取2ml离心管加磨碎的干茶粉末O.lg，加900mL预热至65°C的CTAB提取液，加 2OmL0-疏基乙醇，65°C水浴20min，每隔lOmin轻轻上下摇勾几次，然后加10mL RNAase置于 65°C水浴15min，每隔5min上下摇勾几次。
[0052] ②13000r/min，离心10min，取上清液800mL，加400mL Tris平衡酚，加等体积的氯 仿:异戊醇（氯仿和异戊醇体积比为24:1)至2mL，上下颠倒混匀，13000r/min离心10min，取 上清液